Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği
Summary
Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.
Abstract
Agrobacterium sp. aktarmak ve kendi T-DNA bitkinin genom entegre olanağı olduğu gibi transgenik bitkiler elde etmek için en çok kullanılan yöntemlerinden biridir. Burada, genetik olarak patates (Solanum tuberosum) bitkiler değiştirmek için iki dönüşüm sistemleri mevcut. A. tumefaciens dönüştürme, yaprakları bulaşmış, dönüştürülmüş hücreler seçilir ve yeni tam dönüştürülmüş bitki 18 hafta içinde etki kullanarak yeniden oluşturulur. A. rhizogenes dönüştürme, sapları bakteri bir iğneyle enjekte edilerek bulaşmış, yeni ortaya dönüştürülmüş kıllı kökleri kırmızı bir floresan işaretçisi kullanarak algılanır ve sigara dönüştürülmüş kökleri kaldırılır. 5-6 hafta içinde elde edilen bitki tam gelişmiş dönüştürülmüş kıllı kökleri ile vahşi türü çekimleri karmaşıktır. Biyokütle artırmak için dönüştürülmüş kıllı kökleri eksize kendi kendine yayılır ve. Biz kökleri suberin biyosentetik gen düzenleyici tarafından tahrik GUS muhabir gen ifade elde etmek için her iki aracılı Agrobacterium –dönüştürme yöntemleri uygulanır. GUS boyama yordam sağlanır ve hücre yerelleştirme organizatörü indüksiyon sağlar. Her iki yöntem de GUS GUS faaliyet suberized endodermis ve exodermis ve buna ek olarak, dönüştürülmüş A. rhizogenes kökleri boyama da yan kökler ortaya çıkması algılandı dönüştürülmüş patates kökleri gösterdi. Bu sonuçlar A. rhizogenes kökleri ifade edilir genler çalışmaya hızlı alternatif bir araç olabilir öneririz.
Introduction
Ekonomik çıkarları dışında transgenik bitkilerin üretimi araştırma ultimate işlev genlerin göstermek için ve Bitki fizyolojisi ve geliştirme daha iyi anlamak için kendi ilgisi yok. Bitki DNA ekleme Agrobacteriumiçin en yaygın yöntem kullanılan-dönüşüm aracılı. Agrobacterium tumefaciens crown galls birçok bitki türü virüslü dokuda onun tümör-inducing (Ti) plazmid eylem tarafından elde edebilecektir. Plazmid T-DNA bölge bitki genom entegre edilecek ve doku dedifferentiation1,2neden genlerin bir dizi içerir. T-DNA transgene tarafından bu genlerde alışverişini fenotipik etkileri3kaçınarak belirli bitki değişiklikler nesil izin verdi. T-DNA’sı klonlama transgene kolaylaştırmak için T-DNA bölge Ti plazmid genler kalan süre ikili bir plazmid denilen bir bağımsız plazmid olarak eksize (T-DNA aktarımı ve ekleme mekanizmaları izin virülans genler) olmuştur bir yardımcı plazmid yerleştirilir. Bitki biyoteknoloji araştırmaları için dönüştürme A. tumefaciens tarafından birçok avantajı vardır: Bu pahalı cihazları gerekmez, istikrarlı ve geçici bitki dönüştürme hem Gen kopya içine entegre edilir az sayıda üretmek mümkün Kromozom4. Ancak, çoğu bitkiler ama değil Arabidopsis, kararlı transformants nesil bitki rejenerasyonu tek bir veya birkaç hücre eksojen etki, bu işlem yapma zahmetli ve zaman alıcı kullanarak gerektirir. A. rhizogenes da kıllı kökleri veya kök-inducing (RI) plazmid5‘ te kodlanmış rol (kök loci) gen ifadesi nedeniyle enfeksiyon sitelerdeki adventif kökleri üreten bitki genom değiştirmek yapabiliyor. Her ne kadar daha az A. tumefaciensokudu, A. rhizogenes transgenik kökleri elde etmek için de kullanılır. Bu durumda, A. rhizogenes özgün T-Ri Plazmid ve ikili bir plazmid DNA’sını ikinci bir T-DNA transgene taşıyan içerir. Enfeksiyonu site kaynaklanıyor olsa veya hypocotyls olduğunda, bileşik bir bitki, vahşi türü sürgünler ortaya çıkan yeni kıllı transgenik kökleri ile elde edilebilir. Alternatif olarak, kıllı dönüştürülmüş kökleri özerk vitro ortamda karbon kaynak girişi büyüyebilir. Kök çünkü bitki yeniden oluşturma işlemi gerekli değildir ve bu nedenle daha hızlı ve daha az maliyetli hedef organ olduğunda A. rhizogenes transgenik doku üretmek için A. tumefaciens yerine kullanımı alaka kazanıyor. Önceki çalışmalarda Bu metodoloji kök belirli genler6,7,8,9fenotipik karakterizasyonu için tahsis göstermiştir.
Patates (Solanum tuberosum) gıda ve Tarım Örgütü Birleşmiş Milletler (FAO) göre dünyanın dördüncü en önemli ürün olduğu için yumru vitaminler iyi bir kaynak olduğu için insan tüketimi için beslenme ilgisi vardır ve mineraller. Bu nedenle, patates tarımsal biyoteknoloji spot olarak yerleştirildi ve genetik ve gelişimsel için iyi bir biyolojik model10,11çalışmalar olarak da kabul edilir. Patates dönüşüm önemli genler karakterizasyonu aracılığıyla altta yatan suberized dokularda suberin içinde yer ve biyosentezi12,13,14 balmumu moleküler mekanizmaları anlamak için bulunmuştur ,15,16,17, suberin monomer taşıma18 ve transkripsiyon yönetmelik19. Suberin feruloyl transferaz gene, FHT, bu karakterize biyosentetik genlerin biridir; onun downregülasyon suberin ferulate esterleri güçlü bir düşüş ve Vakslar, patates yumrular14ile ilişkili periderm koruma güçlü bir bozulma artış sağlar. Kullanılazlar, kökleri ve Arabidopsis tohumları, onun sözde orthologue (ASFT/RWP1) nakavt de alkil ferulates suberin20,21üreten rolüne gösterdi. Patates, FHT transkripsiyon muhabir çizgi ve FHT antikor sırasıyla organizatörü etkinlik ve protein exodermis, endodermis, phellogen türevleri ve yaralı doku15yer gösterdi.
Bu çalışmada, bir protokol A. rhizogenes yaban türü çekimleri de sürdürülür transgenik kıllı kökleri üretmek için kullanma, bileşik patates bitkiler oluşturmadan veya özerk içinde vitrobüyümeye eksize ayrıntı. Biz de tam patates transgenik bitkiler elde etmek için A. tumefaciens kullanarak iletişim kuralı sağlar. Bir vaka çalışması olarak A. rhizogenes ve A. tumefaciens ile aynı ikili vektör dönüşüm kökleri GUS muhabir gen ekspresyonu sürüş FHT organizatörü ile almak için kullanılır. Sonuçlar bildirdi ve karşılaştırıldığında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patates, istikrarlı tam transgenik bitkiler elde etmek için en yaygın sistem eksojen etki kullanarak organogenesis gerektiren Agrobacterium tumefaciens suşları tarafından dönüştürme kullanır. Sigara-T-DNA vektör sıra25entegre potansiyeline göre Agrobacterium protokolleri sahip olmasına rağmen bu metodoloji hala en kolay ve daha az pahalı patates bitkiler dönüştürmek kullanılabilir. Son yıl içinde A. rhizogenesilgi-aracılı dönüştürme transgen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser “gayri resmi” de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, PB FPI hibe), “gayri resmi” de Economía y Competitividad ve finansman (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) FEDER ve Girona Üniversitesi (doktora hibe SF ve grant tarafından desteklenmiştir SING11/1). Yazarlar Dr. Inge Broer (arazi kullanımı, üniversite Rostock, Rostock, Almanya Enstitüsü) ve Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, İspanya) A. rhizogenes ve A. tumefaciens zorlanma sağlamak için minnettarız, sırasıyla ve Dr Marçal Soler ve Dr Anna Plasencia A. rhizogenes dönüştürme deneyler başlatılıyor alınan destek ve yardım için (Toulouse III Paul Sabatier Üniversitesi — CNRS, bitki Araştırma Laboratuvarı (LRSV), Castanet Tolosan, Fransa). Yazarlar Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) laboratuvar iş dışarı taşıyan ve bitkiler ve Ferran Fontdecaba ve Carla Sánchez yardımcı bazı deneyler ile onlar yapıyor iken Bakımı onun değerli yardım için teşekkür ederiz onların son derece proje.
Materials
|
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
|
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
|
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
|
Microscope |
Olympus |
||
|
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
|
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
|
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
|
pHmetre |
Crison |
||
|
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
|
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
|
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
|
Vacuum |
Dinko |
||
|
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
Referências
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA’s journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm’s water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -. H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Comportamento. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
