3d Hydrogels में वैश्विक सेलुलर मैट्रिक्स Metalloproteinase और चयापचय गतिविधि को मापने
Summary
यहां, एक प्रोटोकॉल encapsulating और पाली में संवर्धन कोशिकाओं (ईथीलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) hydrogels एक fluorogenic मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) के साथ कार्यात्मक-सड़ पेप्टाइड के लिए प्रस्तुत किया है । सेलुलर एमएमपी और चयापचय गतिविधि hydrogel संस्कृतियों से सीधे एक मानक microplate पाठक का उपयोग कर मापा जाता है ।
Abstract
तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति प्रणालियों अक्सर vivo सेलुलर प्रतिक्रियाओं और पारंपरिक दो आयामी (2d) संस्कृति प्रणालियों की तुलना में कार्यों में अधिक निकटता दोहराऊंगा । हालांकि, 3 डी संस्कृति में सेल समारोह की माप अक्सर अधिक चुनौतीपूर्ण है । कई जैविक परख सेलुलर सामग्री की पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता है जो 3 डी संस्कृतियों में मुश्किल हो सकता है । एक तरह से इस चुनौती का पता करने के लिए नई सामग्री है कि सामग्री के भीतर सेल समारोह के माप को सक्षम विकसित करना है । यहां, एक विधि ९६-well प्रारूप में 3 डी hydrogels में सेलुलर मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) गतिविधि की माप के लिए प्रस्तुत किया है । इस प्रणाली में, एक पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) hydrogel एक fluorogenic एमएमपी सट सेंसर के साथ कार्यात्मक है । सेलुलर एमएमपी गतिविधि प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए आनुपातिक है और एक मानक microplate पाठक के साथ मापा जा सकता है । एक ९६ के लिए इस परख के Miniaturization-अच्छी तरह से प्रारूप प्रयोगात्मक के लिए आवश्यक समय कम ५०% और हालत प्रति ८०% द्वारा एजेंट के उपयोग के रूप में पिछले 24 की तुलना में अच्छी तरह से परख के संस्करण । यह परख भी सेलुलर समारोह के अंय माप के साथ संगत है । उदाहरण के लिए, एक चयापचय गतिविधि परख यहां का प्रदर्शन किया है, जो एक ही hydrogel के भीतर एमएमपी गतिविधि माप के साथ एक साथ आयोजित की जा सकती है । परख मानव मेलेनोमा कोशिका के एक रेंज भर में समझाया कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है घनत्व सीडिंग के लिए उपयुक्त encapsulation घनत्व निर्धारित करने के लिए परख के कार्य रेंज । सेल encapsulation के 24 एच के बाद, एमएमपी और चयापचय गतिविधि readouts कोशिका बोने की सघनता के लिए आनुपातिक थे । जबकि परख यहां एक fluorogenic सड़ सब्सट्रेट के साथ प्रदर्शन किया है, परख और पद्धति hydrogel प्रणालियों और अंय फ्लोरोसेंट सेंसर की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित हो सकता है । इस तरह के एक परख आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए एक व्यावहारिक, कुशल और आसानी से सुलभ 3 डी संवर्धन मंच प्रदान करता है ।
Introduction
तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों अक्सर और अधिक बारीकी से vivo में दोहराऊंगा पारंपरिक दो आयामी (2d) संस्कृति प्रणालियों की तुलना में सेलुलर प्रतिक्रियाओं, कई उत्कृष्ट प्रकाशनों1,2,3 देखें . हालांकि, सेल समारोह को मापने के लिए 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग सेलुलर पुनः प्राप्ति और आगे नमूना प्रसंस्करण की कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है । यह कठिनाई 3 डी संस्कृति प्रणालियों में कई सेलुलर कार्यों का माप सीमा । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, नई तकनीक की जरूरत है कि 3 डी वातावरण के भीतर सेल समारोह के आसान माप सक्षम हैं । एक तरह से इस की जरूरत है पता सामग्री का विकास है कि न केवल 3 डी सेल संस्कृति का समर्थन है, लेकिन यह भी सेंसर को शामिल करने के लिए सेल समारोह को मापने । उदाहरण के लिए, कई hydrogel सिस्टम को शामिल किया है fluorogenic को चिढ़ाना moieties 3 डी वातावरण के भीतर गतिविधि को चिढ़ाने के दृश्य को सक्षम करने के लिए4,5,6,7। हालांकि इन प्रणालियों मूलतः सूक्ष्म इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया, इन प्रणालियों को भी एक वैश्विक मैट्रिक्स metalloproteinase में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (एमएमपी) गतिविधि परख एक मानक प्लेट रीडर का उपयोग कर, एक 3 डी में एक सेल समारोह के सतही माप को सक्षम करने वातावरण८.
MMPs, जिंक का superfamily, सामान्य ऊतक homeostasis में और कई रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । MMPs नीचा और remodel extracellular मैट्रिक्स (ECM), सेल सतह रिसेप्टर्स और साइटोकिंस सट और अन्य MMPs9,10को सक्रिय करें. MMPs शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जैसे कि गठिया, atherosclerosis, अल्जाइमर, और कैंसर जैसे रोगों में घाव हीलिंग और ( 9,10,11में समीक्षाएं देखें) । कैंसर में, उच्च एमएमपी अभिव्यक्ति स्तर दृढ़ता से कैंसर मेटास्टेसिस और गरीब पूर्वानुमान12के साथ संबद्ध हैं । इसके अलावा, MMPs कैंसर सेल आक्रमण और प्रवास को बढ़ावा देने के द्वारा ट्यूमर प्रगति में योगदान, सेलुलर प्रक्रियाओं है कि स्वाभाविक 3 डी घटनाएं13,14। इसलिए, कई संदर्भों में 3 डी संस्कृति में एमएमपी गतिविधि को मापने की क्षमता में बहुत रुचि है, मौलिक जैविक अध्ययन और दवा जांच परख सहित ।
खूंटी hydrogels व्यापक रूप से अपने उच्च जल सामग्री, प्रोटीन सोखना के लिए प्रतिरोध, और स्वरित्र प्रकृति के कारण 3 डी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । खूंटी hydrogels RGD, रालोद की तरह ECM mimetic पेप्टाइड्स के साथ के रूप में सीधे सेल समारोह के लिए moieties की एक संख्या के साथ कार्यात्मक किया गया है, और IKVAV सेल आसंजन की सुविधा के लिए, या विकास कारक बदलने जैसे वृद्धि कारकों के प्रत्यक्ष tethering-β (TGF-β) 15,16. हाल ही में, खूंटी hydrogels संवेदक पेप्टाइड्स कि सेल समारोह के रूप में अच्छी तरह से5,8के माप को सक्षम के साथ कार्यात्मक किया गया है । विशेष रूप से, एक खूंटी hydrogel प्रणाली का उपयोग एक fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक-सड़ सकने योग्य पेप्टाइड एक मानक प्लेट रीडर के साथ 3 डी संस्कृतियों में सेलुलर एमएमपी गतिविधि के माप सक्षम है और कोई आगे प्रसंस्करण की आवश्यकता. इन प्रणालियों भी सेलुलर समारोह के अन्य माप के साथ संगत कर रहे हैं, चयापचय गतिविधि सहित. यहां, एक प्रोटोकॉल एक 3d खूंटी एक fluorogenic एमएमपी के साथ कार्यात्मक hydrogel में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के एमएमपी गतिविधि की माप के लिए वर्णित है, ह्रासी पेप्टाइड, और परिणाम इस के उपयोग के लिए आवश्यक प्रारंभिक अनुकूलन प्रयोगों का प्रदर्शन प्रस्तुत परख. मानव मेलेनोमा कोशिकाओं (A375) fluorogenic hydrogels में समझाया घनत्व सीडिंग की एक सीमा से अधिक उचित सीडिंग घनत्व है कि परख के काम रेंज के भीतर है निर्धारित कर रहे थे । encapsulation के 24 घंटे के बाद, एमएमपी और चयापचय गतिविधि एक मानक microplate पाठक का उपयोग मापा गया । अगले, एमएमपी गतिविधि चयापचय गतिविधि के लिए सामान्यीकृत को परख के रैखिक सीमा के भीतर घनत्व बोने का निर्धारण किया गया । अंत में, भिन्नता प्रतिशत (% CV) की इंट्रा प्लेट गुणांक प्राप्त परिणामों की reproducibility को प्रतिबिंबित करने के लिए triplicates के बीच गणना की गई. इस विधि सरल और तेजी से 3 डी सेल संस्कृति, और ंयूनतम नमूना प्रसंस्करण के साथ गतिविधि की गति को आसान माप सक्षम बनाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
3d इन विट्रो सेल कल्चर recapitulates में वीवो के कई अहम पहलू हैं । हालांकि, 3 डी संस्कृति भी सेल समारोह का आकलन करता है और चुनौतीपूर्ण संकेत, के रूप में कई जैविक परख सेलुलर पुनः प्राप्ति और कोशिकाओं की बड़ी संख्या क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक को ओहियो कैंसर अनुसंधान (ओसीआर), ओह, इस काम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से राजा सऊद विश्वविद्यालय (KSU), रियाद, पहले लेखक के प्रायोजन के लिए केएसए के वित्तपोषण के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका स्वीकार करना चाहते हैं । फ्लोरोसेंट पेप्टाइड संवेदक के आणविक वजन मापा गया था मैट्रिक्स का उपयोग सहायता, लेजर desorption-ionization, समय की उड़ान (मालदी-तोफ) जन स्पेक्ट्रोमेट्री परिसर रासायनिक साधन केंद्र जन स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटियोमिक् से सहायता के साथ ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में सुविधा ।
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
Referências
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