Summary

العزلة والتبني نقل الملح عالية يعامل عرض مستضد الخلايا الجذعية

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية من الطحال مورين بفرز الخلايا المغناطيسية ونقل التبني اللاحقة في الفئران ساذجة. تم اختيار نموذج لتنشيط الخلايا الجذعية الملح عالية شرح إجراءات خطوة بخطوة لنقل التبني والتدفق الخلوي.

Abstract

يسهم في التهاب الزائدة المدخول الغذائي الملح وتلعب دوراً حيويا في تطوير ارتفاع ضغط الدم. وجدنا سابقا أن عرض مستضد الخلايا الجذعية (DCs) بمعنى مرتفعة الصوديوم خارج الخلية، مما يؤدي إلى تفعيل أوكسيديز نادف وتشكيل إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين. هذه إيسولج البروتين adducts تتفاعل مع البروتينات المتمتعة بالحكم الذاتي، وتعزيز المناعة الذاتية مثل الدولة وارتفاع ضغط الدم. لدينا تطوير وتحسين أساليب الدولة للفنون لدراسة وظيفة DC في ارتفاع ضغط الدم. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل للعزلة، في معاملة المختبر مع الصوديوم مرتفعة، والتبني نقل مورين CD11c الطحال+ الخلايا في الفئران المستفيدة لدراسة دورها في ارتفاع ضغط الدم.

Introduction

الملح الغذائية الزائدة عامل خطر رئيسي لارتفاع ضغط الدم. 1 , 2 “جمعية القلب الأمريكية” توصي كحد أقصى 2,300 مليغرام (ملغم) من تناول الصوديوم (Na+) في اليوم الواحد، ومع ذلك؛ أقل من 10% سكان الولايات المتحدة تلاحظ هذه التوصية. 3 , 4 تخفيضات متواضعة في المدخول نا+ انخفاض ضغط الدم، وتقليل حالات جديدة سنوياً من مرض القلب التاجي والسكتة الدماغية في الولايات المتحدة بنسبة 20%. 5 مشكلة رئيسية مع الزيادة في استهلاك الملح هو أن 50 في المائة من السكان ارتفاع ضغط الدم والمعارض الملح-حساسية، ويعرف بزيادة 10 مم زئبق في ضغط الدم بعد نانا+ تحميل أو حدوث انخفاض مماثل في ضغط الدم + القيد وإدرار البول. 6 الملح حساسية كما يحدث في 25% أفراد نورموتينسيفي، وهو توقع مستقلة من الموت وأحداث القلب والأوعية الدموية. 7 , 8 آليات الاستشعار عن الملح في ارتفاع ضغط الدم التي تنطوي على الكلي درست؛ بيد أن الدراسات الحديثة تشير إلى أن الخلايا المناعية يمكن الشعور نا+. 9 , 10

تشير الدلائل الأخيرة إلى أن التغييرات في خارج الكلوية نا+ التعامل مع يمكن أن تسبب تراكم نا+ في إينتيرستيتيوم وتشجيع التهاب. 11 , 12 مختبرنا وغيرها قد أظهرت أن خلايا نظام المناعة الفطرية والتكيف تسهم في تفاقم ارتفاع ضغط الدم. 9 , 13 , 14 , 15 المحفزات فرط ضغط الدم المختلفة، بما في ذلك وحيدات انجيوتنسين الثاني وإفراز والسبب الملح الضامة، والخلايا الليمفاوية T التسلل في الكلي والمفرج وتشجيع استبقاء نا+ ، تضيق الأوعية، وضغط الدم الارتفاع، وتلف الجهاز نهاية. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 وفي الدراسات السابقة، وجدنا أن وحدات تحكم المجال Dc تتراكم إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين في الاستجابة للمحفزات فرط ضغط الدم المختلفة بما في ذلك انجيوتنسين الثاني والملح دوكا ارتفاع ضغط الدم. 14 إيسولجس منتجات وبيروكسيد شدة رد الفعل بسرعة وتساهمي أدوكت إلى ليسينيس على البروتينات وتراكمها ويرتبط مع التنشيط DC. 14 وقد أنشأنا مؤخرا أن نا مرتفعة+ حافز قوي للبروتين إيسولج أدوكت تشكيل في الفئران وساطة وحدات تحكم المجال Dc-9 غ+ الدخول إلى وحدات تحكم المجال Dc عن طريق ناقلي amiloride الحساسة. ثم يتم تبادل نا+ للكالسيوم (Ca2 +) عن طريق+Na/Ca2 + المبادل. Ca2 + تنشيط بروتين كيناز ج (PKC) الذي ينشط أوكسيديز نادف مما أدى إلى زيادة أكسيد فائق (س2·-) والبروتين إيسولج أدوكت تشكيل. 9 نقل التبني المعرضة للملح ضغط الدم يعبي وحدات تحكم المجال Dc استجابة لجرعة موترة الفرعي من انجيوتنسين الثاني. 9

تحديد CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الأنسجة قد اقتصر سابقا على إيمونوهيستوتشيميستري و RT-PCR، والعزلة من وحدات تحكم المجال Dc قد اقتصر على الخلية الفرز حسب التدفق الخلوي. على الرغم من أن التدفق الخلوي الخلية الفرز وسيلة قوية لعزل الخلايا المناعية، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، ويؤدي إلى انخفاض عائد من خلايا قابلة للحياة. ولذلك، نحن الأمثل بروتوكول خطوة بخطوة لهضم الأنسجة والتحفيز في المختبر، والتبني نقل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc لدراسة ارتفاع ضغط الدم.

Protocol

وافقت جامعة فاندربيلت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام الإجراءات الموضحة هنا. يسكن الفئران ورعايتهم وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الصحافة الأكاديميات الوطنية. 2010 المنقحة). 1-عزل الطحال من الفئران إعداد 1640 RPMI: 10% FBS، 0.10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1…

Representative Results

ويمثل الشكل 1 تخطيطي الخطوات الموصوفة أعلاه. يتم فرز الطحال مورين معزولة عن CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc بالخلية المغناطيسية الفرز ومطلي في وسائل الإعلام الملح العادي (NS؛ 150 ميللي مول كلوريد الصوديوم) أو الوسائط الملح العالية (HS؛ ملمول 190 كلوريد الصوديوم) …

Discussion

في البروتوكول الحالي، أننا قد تحسين إجراءات لعزل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الطحال من الفئران وأدوبتيفيلي تحويلها إلى الحيوانات ساذجة لدراسة دور وحدات تحكم المجال Dc في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل ونقل مجموعات فرعية الخلايا المناعية الأخرى بما ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أيد هذا العمل منح “جمعية القلب الأمريكية” POST290900 إلى N.R.B.، 17SDG33670829 L.X. و “المعاهد الوطنية للصحة” منح K01HL130497 لحزب العدالة والتنمية

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

Referências

  1. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
  2. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
  3. Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
  4. Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
  5. He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
  6. Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
  7. Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
  8. Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
  9. Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
  10. Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
  11. Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
  12. Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
  13. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
  14. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
  15. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
  16. Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
  17. Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
  18. Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
  19. Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
  20. Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).

Play Video

Citar este artigo
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

View Video