Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.
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Artigo de método
Isolamento e transferência adotiva de sal alta trataram apresentadoras de células dendríticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Excesso de ingestão sal contribui para a inflamação e desempenha um papel vital no desenvolvimento da hipertensão. Encontramos anteriormente que apresentadoras de células dendríticas (DCs) podem sentido elevado de sódio extracelular, levando a formação de isolevuglandin (IsoLG) e a ativação da oxidase NADPH-proteína adutos. Estes IsoLG-proteína adutos reagem com autoproteínas e promover um estado de doença auto-imune e hipertensão. Temos desenvolvido e otimizado o estado-da-arte métodos para estudar a função DC na hipertensão. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento, em vitro tratamento com elevada de sódio e transferência adotiva de murino CD11c esplênica+ células em camundongos destinatários para estudar o seu papel na hipertensão.
Introdução
Excesso de sal dietético é um importante factor de risco para hipertensão. 1 , 2 the American Heart Association recomenda um máximo de 2.300 miligramas (mg) da ingestão de sódio (Na+) por dia, no entanto; menos de 10% da população dos EUA observa esta recomendação. 3 , 4 modestas reduções na ingestão de at+ baixar a pressão sanguínea e reduzem os anual de novos casos de doença coronariana e acidente vascular cerebral nos Estados Unidos em 20%. 5 um grande problema com o consumo de sal em excesso é que 50% d....
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Protocolo
Da Universidade de Vanderbilt institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado os procedimentos aqui descritos. Os ratos são alojados e cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (imprensa nacional de academias. Revista 2010).
1. isolamento de baços de ratos
- Preparar RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sódio 1 mM, 50 µM β-Mercaptoetanol e 1% penicilina/estreptomicina.
- Eutanásia em 10 – 12 semana-velhos camundongos C57bl/6 do sexo masculino por inalação de CO2 . Pulverize o peito e os lados do rato com etanol a 70%. No lado esquerdo, abra cuidadosamente a pele....
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Resultados
A Figura 1 representa um esquema dos passos descritos acima. Baços murino isolados são classificados para CD11c+ DCs por célula magnético classificação e banhado em mídia sal normal (NS; 150 mmol de NaCl) ou alta mídia sal (HS; 190 mmol de NaCl), por 48 h. CD11c+ DCs enviaram então são transferidos por retrô-orbital injeção de destinatário ratos ingênuos. Dez dias depois, os ratos são implantados com minipumps osmótica para infusão de (1.......
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Discussão
No actual protocolo, otimizamos os procedimentos para isolar CD11c+ DCs de baços de ratos e enviaram transferi-los para animais ingênuo para estudar o papel da DCs na hipertensão induzida por sal. Este protocolo pode ser adaptado para isolar e enviaram transferir outros subconjuntos de células imunes, incluindo macrófagos, monócitos e células do sistema imunológico adaptativas incluindo linfócitos T e B. Otimizamos o processo de digestão esplênica para alcançar a sobrevivência celular adequada e estabilidade d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association concede POST290900 a N.R.B., 17SDG33670829, L.X. e National Institutes of Health conceder K01HL130497 a A.K.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Colagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS sem cálcio e magnésio | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Reagente Bloqueador | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tubo | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Dispositivo dissociador GentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 Protocolo de | uso: Baço 04.01 |
| Kit de coloração de células mortas violetas fixáveis LIVE/DEAD | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Separador QuadroMACs | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 médio | Gibco | 11835-030 |
Referências
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
- Lev-Ran, A., Porta, M.
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Reimpressões e permissões
