Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien
Summary
Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.
Abstract
Durchflusszytometrie (FC) ist die Methode der Wahl zur semi-quantitativen Messung der Zelloberfläche Antigen Marker. Vor kurzem hat diese Technik für phänotypische Analysen von extrazellulären Vesikeln (EV) einschließlich Exosomen (Exo) im peripheren Blut und anderen Körperflüssigkeiten verwendet worden. Die geringe Größe des EV schreibt die Verwendung von speziellen Instrumenten mit einer Nachweisgrenze um 50-100 nm. Alternativ kann EV an Latex Microbeads gebunden werden, die vom FC erkannt werden können. Microbeads, konjugiert mit Antikörpern, die EV-assoziierten Marker/Cluster Differenzierung CD63, CD9 und CD81 erkennen kann verwendet werden für EV erfassen. Exo isoliert von CM kann mit oder ohne Voranreicherung durch Ultrazentrifugation analysiert werden. Dieser Ansatz eignet sich für EV-Analysen mit konventionellen FC Instrumenten. Unsere Ergebnisse zeigen eine lineare Korrelation zwischen bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Werte und EV-Konzentration. Stören EV durch Beschallung drastisch verringerte MFI, darauf hinweist, dass die Methode nicht Membran Schutt erkennt. Wir berichten über eine genaue und zuverlässige Methode für die Analyse von Oberflächenantigenen EV, die leicht in jedem Labor durchgeführt werden können.
Introduction
Zellen sezernieren extrazelluläre Vesikel (EV) in verschiedenen Größen, einschließlich Microvesicles (MV) und Exosomen (Exo). Letzteres kann aus MV durch Größe und subzelluläre Abteil des Ursprungs unterschieden werden. MV (200 – 1.000 nm Größe) von Vergießen von der Plasmamembran von übergeordneten Zellen freigesetzt werden. Im Gegensatz dazu Exo (30-150 nm) stammen aus Endosomal Membranen und in den Extrazellulärraum freigesetzt werden, wenn die multivesicular Körper (MVB) verschmelzen mit der Zellmembran1,2.
EV werden zunehmend als diagnostischen Biomarkern verwendet, sowie als, potenziell, therapeutische Hilfsmittel in vielen Bereichen, einschließlich Onkologie, Neurologie, Kardiologie und Erkrankungen des Bewegungsapparates3,4,5. Eine große Mehrheit der laufenden Studien mit EV als Therapeutika die Isolation von Vesikeln aus Zelle konditioniertes Medium (CM) der in-vitro kultivierten Zellen nutzen. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) ausüben, wohltuende Wirkung in mehreren Kontexten und MSC-abgeleitete EV haben Vorteile in den Modellen der myokardialen Ischämie/Reperfusion Verletzungen6 und Gehirn Verletzungen7gezeigt. MSC-abgeleitete EV auch ausstellen Immunsystem modulierende Aktivitäten, die zur Immunabwehr, Behandlung genutzt werden können, wie in einem Modell der Therapie-refraktären Graft – Versus – Host-Seuche8gezeigt. Amniotische Flüssigkeit Stammzellen (hAFS) bereichern aktiv CM mit MVs und Exo, heterogen verteilt in der Größe (50-1.000 nm), die mehrere biologische Wirkungen, z. B. Verbreitung von differenzierten Zellen, Angiogenese, Hemmung der Fibrose, vermitteln und Herzschutz-4. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass EV und vor allem Exo, abgesondert von menschlichen Herz-Kreislauf-abgeleitete Vorläuferzellen (Exo-CPC) verkleinern myokardialen Infarkt in Ratten5,9.
Exo-Aktie einen gemeinsamen Satz von Proteine auf ihrer Oberfläche, einschließlich Tetraspanins (CD63, CD81, CD9) und großen Histocompatibility complex Klasse I (MHC-ich). Neben dieser gemeinsamen Reihe von Proteinen Exo enthalten auch Proteine spezifisch für die EV-Teilmenge des Zelltyps Produzent. Exo-Marker gewinnen größter Bedeutung, weil sie eine entscheidende Rolle bei Inter Zellkommunikation, dadurch regulieren viele biologische Prozesse5,10spielen. Aufgrund ihrer geringen Größe, zu finden einer einfachen Möglichkeit, analysieren, EV mit klassischen Flow Cytometry (FC) bleibt eine große Herausforderung.
Hier präsentieren wir Ihnen ein vereinfachtes Protokoll für EV-Analyse mit FC, die in Pre-angereicherten Proben durch Ultrazentrifugation oder direkt in CM (Abbildung 1) angewendet werden können. Die Methode verwendet Perlen mit einem spezifischen Antikörper, der kanonischen Exo-assoziierten Oberfläche Epitope (CD63, CD9, CD81) bindet beschichtet ohne zusätzliche Waschungen. FC-Analysen können mit einer herkömmlichen Cytometer ohne die Notwendigkeit für Anpassungen vor Messungen durchgeführt werden. Methoden zur Charakterisierung von Antigenen auf einzelne kleine Teilchen mit fließen Cytometers wurden von anderen Gruppen in Bezug auf verschiedene Anwendungen11,12,13beschrieben. Hier verwendeten wir funktionalisierten magnetische Beads für den Fang von kleinen Partikeln und Exo, gefolgt von Phänotypisierung von erfassten Partikel von FC. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um die Antigenen Zusammensetzung von kleinen Vesikeln freigesetzt durch jeden Zelltyp in-vitro-zu charakterisieren, hier zur Verfügung gestellten wir bestimmte Zelle Kulturbedingungen, die gelten für die Kultur der menschlichen kardialen Vorläuferzellen (CPC) und die meisten geeigneter Rahmenbedingungen für die Produktion von EV von diesen Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konventionelle FC Technik bleibt die einfachste analytische Methode Marker auf die Oberfläche des EV ausgedrückt zu charakterisieren. In diesem Zusammenhang ist die Auswahl des am besten geeigneten Protokolls wichtig, nützliche Informationen über die einzelnen Teilchen Bruchteile von Interesse zu erhalten, durch die Vermeidung von Einschränkungen aufgrund der Empfindlichkeit des Instruments. Wir beschrieben eine Methode mit magnetischen Partikeln gepaart mit Antikörpern, die erkennen Exo und kleine EV Oberflächena…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.b. wurde von Forschungsstipendien der Helmut Horten Stiftung und Velux Stiftung, Zürich (Schweiz) unterstützt. G.V wurde von Forschungsstipendien des Schweizerischen Nationalfonds, die Cecilia-Augusta-Stiftung, Lugano und der SHK-Stiftung Für Herz Und Kreislaufkrankheiten (Schweiz) unterstützt.
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
Referências
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