تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق
Summary
البروتوكول وصف أسلوب استنساخه مصممة للاستخدام مع supernatants ثقافة الخلية للكشف عن سطح [ابيتوبس] في حويصلات صغيرة خارج الخلية (EV). فإنه يستخدم إيمونوبريسيبيتيشن EV محددة باستخدام الخرز مقترنة بالأجسام المضادة التي تعترف بسطح مستضد CD9، CD63، و CD81. الأسلوب هو الأمثل للتحليل الخلوي تدفق المتلقين للمعلومات.
Abstract
التدفق الخلوي (FC) هو الأسلوب المفضل للقياس الكمي شبه علامات مستضد سطح الخلية. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الأسلوب لتحليلات المظهرية من حويصلات خارج الخلية (EV) بما في ذلك اكسوسوميس (Exo) في الدم المحيطي وسوائل الجسم الأخرى. صغر حجم EV ولايات استخدام صكوك مخصصة لها عتبة الكشف عن حوالي 50-100 نانومتر. وبدلاً من ذلك، يمكن ربط EV ميكروبيدس مطاط يمكن الكشف عنها بواسطة FC. يمكن استخدام ميكروبيدس، مترافق مع الأجسام المضادة التي تعترف بعلامات/الكتلة المرتبطة EV CD63 التمايز و CD9 و CD81 لالتقاط EV. يمكن تحليل أكسو معزولة عن سم مع أو بدون تخصيب اليورانيوم قبل واسطة تنبيذ فائق. وهذا النهج مناسبة لتحليلات EV باستخدام الصكوك FC التقليدية. وتبين النتائج التي توصلنا إليها ارتباط خطي بين قيم كثافة Fluorescence يعني (MFI) وتركيز EV. تعطيل EV خلال sonication هائلة انخفضت مؤسسة مونتانيار، مما يشير إلى أن الأسلوب لا يكشف عن الحطام الغشاء. ونحن التقرير طريقة دقيقة وموثوق بها لتحليل المستضدات السطحية EV، التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر.
Introduction
تفرز خلايا الحويصلات خارج الخلية (EV) ذات أحجام مختلفة بما في ذلك ميكروفيسيكليس (MV) واكسوسوميس (Exo). يمكن التمييز بين هذا الأخير من السيارات حسب الحجم وحجرة سوبسيلولار الأصلية. يتم تحرير MV (200 – 1,000 نانومتر في الحجم) من الخلايا الأصل قبل ذرف من غشاء البلازما. على العكس من ذلك، تنبع من الأغشية اندوسومال أكسو (30-150 nm) وهي التي تطلق في الفضاء خارج الخلية عندما تلتحم الهيئات مولتيفيسيكولار (مفب) مع غشاء الخلية1،2.
EV بصورة متزايدة كالمؤشرات الحيوية التشخيص كذلك، يحتمل أن تكون، أدوات العلاجية في العديد من المجالات بما في ذلك الأورام والأمراض العصبية وأمراض القلب وأمراض العظام والعضلات3،،من45. غالبية العظمى من الدراسات الجارية باستخدام EV باستغلال العوامل العلاجية عزلة حويصلات من تكييف الخلية المتوسطة (سم) من الخلايا المزروعة في المختبر. الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) تأثيراً مفيداً في عدة سياقات، والمستمدة من لجنة السلامة البحرية EV أظهرت فوائد في نماذج من احتشاء عضلة القلب الاسكيمية/ضخه إصابة6 والدماغ إصابة7. كما يحمل EV المستمدة من لجنة السلامة البحرية محصنة ضد الأنشطة مودولاتوري التي يمكن استغلالها لعلاج الرفض المناعي، كما هو موضح في نموذج للعلاج-صهر الاختلاس – مقابل – المضيف المرض8. بنشاط تخصيب الخلايا الجذعية السائل السلوى (حفص) سم مع MVs واكسو، موزعة بين في الحجم (50 – 1,000 nm)، التي تتوسط العديد من الآثار البيولوجية، مثل انتشار الخلايا المتمايزة، والأوعية، وتثبيط التليف، و كارديوبروتيكشن4. ونحن قد أظهرت مؤخرا أن قيمة المنشأة، ولا سيما أكسو، يفرز من الخلايا البشرية السلف المستمدة من القلب (أكسو-الحزب الشيوعي الصيني) تقليل حجم احتشاء عضلة القلب في الفئران5،9.
أكسو حصة مجموعة مشتركة من البروتينات على سطحها، بما في ذلك تيتراسبانينس (CD63، CD81، CD9) و histocompatibility الرئيسية المعقدة الفئة الأولى (MHC–أنا). وبالإضافة إلى هذه المجموعة المشتركة من البروتينات، كما أكسو تحتوي على بروتينات محددة ل EV مجموعة فرعية من نوع الخلية المنتجة. علامات أكسو تكتسب أهمية قصوى لأنها تلعب دوراً حاسما في الاتصالات بين الخلوية، وبالتالي تنظم العديد من العمليات البيولوجية5،10. بسبب صغر حجمها، إيجاد طريقة سهلة لتحليل EV استخدام الكلاسيكية التدفق الخلوي (FC) يظل مهمة صعبة.
وهنا، يقدم بروتوكول مبسط لتحليل EV استخدام FC، التي يمكن تطبيقها للتخصيب قبل العينات التي تم الحصول عليها من خلال تنبيذ فائق أو مباشرة إلى سم (الشكل 1). يستخدم الأسلوب حبات مغلفة بجسم معين التي تربط الكنسي المرتبطة أكسو السطحية [ابيتوبس] (CD63, CD9, CD81) دون يغسل إضافية. يمكن إجراء تحليلات FC استخدام cytometer تقليدية مع عدم وجود حاجة لإجراء تعديلات قبل القياسات. وقد وصف أساليب لتوصيف المستضدات على جزيئات صغيرة فردية باستخدام سيتوميتيرس تدفق مجموعات أخرى فيما يتعلق بمختلف تطبيقات11،،من1213. هنا، استخدمنا حبات المغناطيسية فونكتيوناليزيد لإلقاء القبض على جزيئات صغيرة واكسو، تليها phenotyping الجزيئات الملتقطة بنادي. على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد خصائص مستضدي تكوين حويصلات صغيرة صدر عن أي نوع من الخلايا في المختبر، هنا قدمنا شروط ثقافة الخلية المحددة التي تنطبق لثقافة السلف القلب البشري خلايا (الحزب الشيوعي) وأكثر البيئة المناسبة لإنتاج EV بهذه الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويظل التقليدية FC تقنية الأسلوب التحليلي الأكثر مباشرة لتوصيف علامات على السطح EV وأعرب عن. وفي هذا الصدد، تحديد بروتوكول أنسب أمر حاسم للحصول على معلومات مفيدة عن الكسور الجسيمات الفردية للاهتمام بتجنب القيود بسبب حساسية الصك. وصفت لنا طريقة استخدام الجسيمات المغناطيسية مقترنة بالأجسام ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد L.B. المنح البحثية هلموت هورتين ستيفتونغ وفيلا شتيفتونغ، زيوريخ (سويسرا). وأيده كل المنح البحثية لمؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، ومؤسسة سيسيليا-أوغوستا، لوغانو، و “الشيخ ستيفتونغ” für هيرز أوند كريسلاوفكرانخيتين (سويسرا)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
Referências
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
