प्रोटोकॉल छोटे extracellular बुलबुले (EV) पर सतह epitopes का पता लगाने के लिए सेल कल्चर supernatants के साथ प्रयोग के लिए तैयार एक reproducible विधि का वर्णन करता है । यह विशिष्ट EV immunoprecipitation एंटीबॉडी कि सतह प्रतिजन CD9, CD63, और CD81 पहचान के साथ मिलकर मोतियों का उपयोग कर इस्तेमाल करता है । विधि बहाव प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अनुकूलित है ।
फ्लो cytometry (एफसी) सेल-सतह प्रतिजन मार्कर के अर्द्ध मात्रात्मक माप के लिए पसंद की विधि है । हाल ही में, इस तकनीक को परिधीय रक्त और अन्य शरीर के तरल पदार्थ में exosomes (Exo) सहित extracellular बुलबुले (EV) के phenotypic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । EV जनादेश के छोटे आकार 50-100 एनएम के आसपास एक का पता लगाने दहलीज होने समर्पित उपकरणों का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, EV लेटेक्स microbeads के लिए बाध्य किया जा सकता है कि एफसी द्वारा पता लगाया जा सकता है । Microbeads, एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित जो ev-संबद्ध मार्करों/Cluster of विभेद CD63, CD9, और CD81 का इस्तेमाल ev कैप्चर के लिए किया जा सकता है । सेमी से पृथक Exo के साथ या पूर्व संवर्धन के बिना ultracentrifugation द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण EV विश्लेषण पारंपरिक एफसी उपकरणों का उपयोग करने के लिए उपयुक्त है । हमारे परिणाम प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) मूल्यों और EV एकाग्रता मतलब के बीच एक रैखिक सहसंबंध प्रदर्शित करता है । इस विधि झिल्ली मलबे का पता नहीं लगाता है, यह दर्शाता है कि sonication के माध्यम से EV नाटकीय रूप से कम MFI में खलल न डालें । हम EV surface एंटीजन के विश्लेषण के लिए एक सटीक और विश्वसनीय विधि की रिपोर्ट करते हैं, जिसे किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से लागू किया जा सकता है ।
कोशिकाओं microvesicles (एमवी) और exosomes (Exo) सहित विभिन्न आकारों के extracellular बुलबुले (EV) स्रावित । बाद दोनों आकार और मूल के उपसेलुलर डिब्बे से एमवी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । एमवी (200 – आकार में 1000 एनएम) प्लाज्मा झिल्ली से बहा द्वारा माता पिता की कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं । इसके विपरीत, Exo (30-150 एनएम) endosomal झिल्ली से शुरू होता है और extracellular अंतरिक्ष में जारी किए जाते है जब multivesicular शरीर (MVB) सेल झिल्ली1,2के साथ फ्यूज ।
EV तेजी से नैदानिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग किया जाता है, संभवतः, कैंसर विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, कार्डियोलोजी, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस3,4,5सहित कई क्षेत्रों में चिकित्सीय उपकरण । चल रहे अध्ययनों का एक विशाल बहुमत चिकित्सीय एजेंटों के रूप में EV का उपयोग सेल से बुलबुले के अलगाव का फायदा उठाने के वातानुकूलित माध्यम (सेमी) इन विट्रो में प्रसंस्कृत कोशिकाओं । Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) कई संदर्भों में लाभकारी प्रभाव डालती है, और एमएससी-व्युत्पंन EV के मॉडल में लाभ दिखाया गया है रोधगलन/reperfusion चोट6 और मस्तिष्क चोट7। एमएससी-व्युत्पंन EV भी प्रतिरक्षा modulatory गतिविधियों है कि प्रतिरक्षा अस्वीकृति के इलाज के लिए शोषण किया जा सकता है प्रदर्शन, के रूप में चिकित्सा के एक मॉडल में प्रदर्शन-दुर्दम्य भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग8। एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं (hAFS) सक्रिय रूप से MVs और Exo के साथ सेमी समृद्ध, विषम रूप से आकार में वितरित (50-1000 एनएम), जो इस तरह के विभेदित कोशिकाओं के प्रसार के रूप में कई जैविक प्रभाव, मध्यस्थता, angiogenesis, फाइब्रोसिस के निषेध, और cardioprotection4. हम हाल ही में दिखाया है कि EV, और विशेष रूप से Exo, मानव कार्डियक द्वारा स्रावित जनक कोशिकाओं (Exo-सीपीसी) चूहों में infarct आकार कम रोधगलन5,9.
Exo tetraspanins (CD63, CD81, CD9) और प्रमुख histocompatibility जटिल वर्ग मैं (MHC-i) सहित, उनकी सतह पर प्रोटीन का एक आम सेट साझा करें । प्रोटीन के इस आम सेट के अलावा, Exo भी उत्पादक सेल प्रकार के EV सबसेट के लिए विशिष्ट प्रोटीन होते हैं । Exo मार्करों सर्वोपरि महत्व प्राप्त कर रहे है क्योंकि वे अंतर में एक महत्वपूर्ण भूमिका सेलुलर संचार, जिससे कई जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित5,10। क्योंकि उनके छोटे आकार के, एक आसान तरीका है EV शास्त्रीय प्रवाह cytometry (एफसी) का उपयोग कर एक चुनौतीपूर्ण कार्य रहता है खोज ।
यहां, हम EV एफसी का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल मौजूद है, जो ultracentrifugation के माध्यम से या सीधे सेमी (चित्रा 1) के माध्यम से प्राप्त पूर्व समृद्ध नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है । विधि अतिरिक्त बहाकर बिना विहित Exo-संबद्ध सतह epitopes (CD63, CD9, CD81) बांधता है कि एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेपित मोतियों का उपयोग करता है । एफसी विश्लेषण समायोजन के लिए कोई ज़रूरत नहीं माप से पहले के साथ एक पारंपरिक cytometer का उपयोग किया जा सकता है । प्रतिजनों के लक्षण वर्णन के लिए विधियां अलग छोटे प्रवाह cytometers का उपयोग कर कणों पर विभिंन अनुप्रयोगों के संबंध में अंय समूहों द्वारा वर्णित किया गया है11,12,13। यहां, हम छोटे कणों और Exo, एफसी द्वारा कब्जा कर लिया कणों के phenotyping के बाद के कब्जा के लिए कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों का इस्तेमाल किया । हालांकि इस विधि के लिए छोटे इन विट्रो में किसी भी कोशिका प्रकार द्वारा जारी बुलबुले की प्रतिजनी संरचना विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां हम विशिष्ट सेल संस्कृति की स्थिति है कि मानव कार्डियक जनक कोशिकाओं की संस्कृति के लिए आवेदन (सीपीसी) प्रदान की और सबसे इन कोशिकाओं द्वारा EV के उत्पादन के लिए उपयुक्त वातावरण ।
पारंपरिक एफसी तकनीक सबसे सरल विश्लेषणात्मक तरीका EV की सतह पर व्यक्त मार्करों की विशेषता बनी हुई है । इस संबंध में, सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल का चयन साधन संवेदनशीलता के कारण सीमाओं से परहेज द्वारा ब्याज क?…
The authors have nothing to disclose.
L.B. हेल्मुट Horten Stiftung और Velux Stiftung, ज्यूरिख (स्विट्जरलैंड) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । G.V. स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन, सीसिलिया-Augusta फाउंडेशन, लूगानो, और SHK Stiftung फर Herz-und Kreislaufkrankheiten (स्विट्जरलैंड) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था
IMDM | Gibco | 12440061 | |
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |