O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.
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Artigo de método
Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Citometria de fluxo (FC) é o método de escolha para medição semi quantitativa de marcadores de antígeno de superfície da célula. Recentemente, esta técnica tem sido usada para análise fenotípica das vesículas extracelulares (EV), incluindo exosomes (Exo) no sangue periférico e outros fluidos corporais. O pequeno tamanho da EV exige o uso de instrumentos dedicados, tendo um limite de deteção em torno de 50-100 nm. Alternativamente, o EV pode ser vinculado a microbeads látex que pode ser detectado pelo FC. Microbeads, conjugados com anticorpos que reconhecem EV-associado marcadores/Cluster de diferenciação CD63 CD9 e CD81 pode ser usado para captura de EV. EXO isolada de CM pode ser analisado com ou sem pré-enriquecimento por ultracentrifugação. Esta abordagem é adequada para análises de EV usando instrumentos convencionais de FC. Nossos resultados demonstram uma correlação linear entre os valores de intensidade de fluorescência dizer (IFM) e concentração de EV. Perturbar o EV através de sonication drasticamente diminuída IFM, indicando que o método não detecta os restos de membrana. Nós relatamos um exato e confiável método para a análise de antígenos de superfície EV, que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório.
Introdução
As células secretam vesículas extracelulares (EV) de tamanhos diferentes, incluindo aumentada (MV) e exosomes (Exo). Este último pode ser distinguido MV por ambos o tamanho e o compartimento subcelular de origem. MV (200 – 1.000 nm de tamanho) são liberados de células pai derramando da membrana plasmática. Por outro lado, Exo (30-150 nm) originam CDDP membranas e são liberados no espaço extracelular, quando os corpos multivesiculares (MVB) se fundem com a membrana celular1,2.
EV são cada vez mais utilizados como biomarcadores de diagnósticos, bem como, potencialmente, ferramentas te....
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Protocolo
1. coleta e processamento de mídia condicionado
- Casaco 55 cm2 placas de Petri com gelatina de pele suína 0,02% em PBS.
- Placa CPC (8.000/cm2) em pratos revestidos com 7 mL de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) suplementado com 20% FBS (soro Fetal bovino) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
Nota: O termo "CPC" refere-se a células do explante humana derivada que têm sido descritos em outros lugares14. CM pode ser coletada de diferentes tipos de células cultivados em condições de cultura específica. Usar luvas e sob uma capa biológica. - Uma vez que as células alcançar ....
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Resultados
Número total de partículas para a coloração única
Desde um único talão pode vincular mais de uma partícula, testamos diferentes condições para definir a menor quantidade de total EV (único anticorpo por tubo) para alcançar a fase adiantada exponencial da curva de IFM. Uma concentração fixa de anticorpo foi usada enquanto o número total de partículas variou de 5 x 105 a 2,5 x 108. Como mostr.......
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Discussão
Técnica convencional de FC continua a ser o mais simples método analítico para caracterizar marcadores expressados na superfície do EV. A este respeito, selecionar o protocolo mais apropriado é fundamental para obter informações úteis sobre frações de partículas individuais de interesse, evitando limitações devido a sensibilidade do instrumento. Nós descrevemos um método usando partículas magnéticas juntamente com anticorpos que reconhecem a Exo e pequeno EV antígenos de superfície que são apropriados para a aplicação de.......
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Divulgações
Nada a declarar.
Agradecimentos
L.B. foi apoiado por bolsas de investigação de Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurique (Suíça). G.V. foi apoiado por bolsas de investigação da Swiss National Science Foundation, Fundação Cecilia-Augusta, Lugano e o SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suíça)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, plataforma de citômetro de fluxo | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, glicose alta, HEPES, sem vermelho de fenol | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Kit de Captura | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| FBS Empobrecido por Exossomo | Thermofisher | A2720801 | |
| Suplemento de Mídia FBS Empobrecido com Exossomo | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Soro Bovino Fetal | Gibco | 10270106 | |
| FITC anticorpo CD9 humano | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Software de análise de citômetro de fluxo | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| Software NanoSight | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anticorpo CD63 humano | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-CD81 humano (TAPA-1) Anticorpo | Biolegend | 349505 RRID: AB_10642024 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotores |
Referências
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).
- Yadav....
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Reimpressões e permissões
