Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media
Summary
O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.
Abstract
Citometria de fluxo (FC) é o método de escolha para medição semi quantitativa de marcadores de antígeno de superfície da célula. Recentemente, esta técnica tem sido usada para análise fenotípica das vesículas extracelulares (EV), incluindo exosomes (Exo) no sangue periférico e outros fluidos corporais. O pequeno tamanho da EV exige o uso de instrumentos dedicados, tendo um limite de deteção em torno de 50-100 nm. Alternativamente, o EV pode ser vinculado a microbeads látex que pode ser detectado pelo FC. Microbeads, conjugados com anticorpos que reconhecem EV-associado marcadores/Cluster de diferenciação CD63 CD9 e CD81 pode ser usado para captura de EV. EXO isolada de CM pode ser analisado com ou sem pré-enriquecimento por ultracentrifugação. Esta abordagem é adequada para análises de EV usando instrumentos convencionais de FC. Nossos resultados demonstram uma correlação linear entre os valores de intensidade de fluorescência dizer (IFM) e concentração de EV. Perturbar o EV através de sonication drasticamente diminuída IFM, indicando que o método não detecta os restos de membrana. Nós relatamos um exato e confiável método para a análise de antígenos de superfície EV, que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório.
Introduction
As células secretam vesículas extracelulares (EV) de tamanhos diferentes, incluindo aumentada (MV) e exosomes (Exo). Este último pode ser distinguido MV por ambos o tamanho e o compartimento subcelular de origem. MV (200 – 1.000 nm de tamanho) são liberados de células pai derramando da membrana plasmática. Por outro lado, Exo (30-150 nm) originam CDDP membranas e são liberados no espaço extracelular, quando os corpos multivesiculares (MVB) se fundem com a membrana celular1,2.
EV são cada vez mais utilizados como biomarcadores de diagnósticos, bem como, potencialmente, ferramentas terapêuticas em muitos campos, incluindo oncologia, Neurologia, Cardiologia e doenças músculo-esqueléticas3,4,5. A grande maioria dos estudos em andamento usando EV como agentes terapêuticos exploram o isolamento das vesículas da célula-condicionado médio (CM) de células cultivadas in vitro. Células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem efeitos benéficos em diversos contextos, e MSC-derivado EV demonstraram benefícios em modelos de isquemia/reperfusão do miocárdio lesão6 e cérebro lesão7. MSC-derivado EV também apresentam atividades moduladora imunológica que podem ser exploradas para tratar a rejeição imune, como demonstrado em um modelo de terapia refractários doença enxerto – versus – host8. Células tronco de líquido amniótico (hAFS) ativamente enriquecer CM com MVs e Exo, heterogénea em tamanho (50 – 1.000 nm), que mediam vários efeitos biológicos, tais como a proliferação de células diferenciadas, angiogênese, inibição da fibrose, e Cardioprotection4. Recentemente mostramos que EV e particularmente Exo, secretado pelas células progenitoras cardíacas-derivado humano (Exo-CPC) reduzem o tamanho do infarto do miocárdio em ratos5,9.
EXO compartilhar um conjunto comum de proteínas em sua superfície, incluindo tetraspanins (CD9 CD63, CD81,) e o complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC-eu). Além desse conjunto comum de proteínas, Exo também contêm proteínas específicas para o subconjunto de EV, o tipo de células do produtor. EXO marcadores estão ganhando maior importância porque eles desempenham um papel crucial na comunicação intercelular, regulando, assim, muitos processos biológicos5,10. Por causa de seu tamanho pequeno, de encontrar uma maneira fácil de analisar EV usando clássica fluxo cytometry (FC) permanece uma tarefa desafiadora.
Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para análise de EV usando FC, que pode ser aplicado em pré-enriquecidas amostras obtidas através de ultracentrifugação ou diretamente em CM (Figura 1). O método usa pérolas revestidas com anticorpo específico que se liga canônicos epitopos superfície Exo-associados (CD63, CD9, CD81) sem lavagens adicionais. Análises FC podem ser realizadas usando um citômetro convencional sem necessidade de ajustes antes da medição. Métodos para a caracterização dos antígenos em partículas pequenas individuais usando citômetros têm sido descritos por outros grupos no que diz respeito a várias aplicações11,12,13. Aqui, usamos funcionalizados grânulos magnéticos para a captura de partículas pequenas e Exo, seguido por fenotipagem de partículas capturadas pelo FC. Embora esse método pode ser usado para caracterizar a composição antigênica de pequenas vesículas lançado por qualquer tipo de células in vitro, aqui nós fornecemos condições de cultura de células específicas que se aplicam para a cultura de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) e a maioria ambiente adequado para a produção de EV por essas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnica convencional de FC continua a ser o mais simples método analítico para caracterizar marcadores expressados na superfície do EV. A este respeito, selecionar o protocolo mais apropriado é fundamental para obter informações úteis sobre frações de partículas individuais de interesse, evitando limitações devido a sensibilidade do instrumento. Nós descrevemos um método usando partículas magnéticas juntamente com anticorpos que reconhecem a Exo e pequeno EV antígenos de superfície que são apropriados…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. foi apoiado por bolsas de investigação de Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurique (Suíça). G.V. foi apoiado por bolsas de investigação da Swiss National Science Foundation, Fundação Cecilia-Augusta, Lugano e o SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suíça)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
Referências
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