Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media
Summary
Protokollet beskrivs en reproducerbar metod utformad för användning med cell cellkulturer för att upptäcka ytan epitoper på små extracellulära blåsor (EV). Det använder specifika EV immunoprecipitation använder pärlor tillsammans med antikroppar som känner igen ytantigen CD9, CD63 och CD81. Metoden är optimerad för nedströms Flödesanalys flödescytometri.
Abstract
Flödescytometri (FC) är metoden för val av semi kvantitativ mätning av cellytan antigen markörer. Denna teknik har nyligen använts för fenotypisk analyser av extracellulära blåsor (EV) inklusive exosomes (Exo) i perifert blod och andra kroppsvätskor. Den lilla storleken på EV mandat användningen av särskilda instrument med en påvisbara gränsen runt 50-100 nm. Alternativt kan EV vara bunden till latex mikrokulor som kan upptäckas av FC. Mikrokulor, konjugerat med antikroppar som känner igen EV-associerade markörer/kluster av differentiering CD63, CD9 och CD81 kan användas för EV fånga. EXO isolerade från CM kan analyseras med eller utan före berikning av ultracentrifugering. Denna metod är lämplig för EV analyser med hjälp av konventionella FC instrument. Våra resultat visar en linjär korrelation mellan menar fluorescens intensitet (MFI) värden och EV koncentration. Störa EV genom ultraljudsbehandling dramatiskt minskade MFI, som visar att metoden inte upptäcker membran skräp. Vi rapporterar en korrekt och tillförlitlig metod för analys av EV ytantigener, som lätt kan genomföras i ett laboratorium.
Introduction
Celler utsöndrar extracellulära blåsor (EV) av olika storlekar, inklusive microvesicles (MV) och exosomes (Exo). Den senare kan skiljas från MV både storlek och subcellulär facket av ursprung. MV (200-1000 nm i storlek) frigörs från överordnade celler genom utgjuta från plasmamembranet. Omvänt, Exo (30 – 150 nm) härstammar från endosomal membran och släpps ut i det extracellulära utrymmet när de multivesicular organen (MVB) säkring med cellmembranet1,2.
EV blir alltmer används som diagnostiska markörer samt som, potentiellt, terapeutiska verktyg inom många områden bland annat onkologi, neurologi, kardiologi och muskuloskeletala sjukdomar3,4,5. En stor majoritet av pågående studier med EV som terapeutiska medel utnyttja isolering av blåsor från cell-villkorade medium (CM) av in vitro-odlade celler. Mesenkymala stamceller (MSC) utöva gynnsamma effekter i flera sammanhang och MSC-derived EV har visat fördelar i modeller av myokardischemi/reperfusion skada6 och hjärnan skada7. MSC-derived EV uppvisar också immun immunmodulerande aktiviteter som kan utnyttjas för att behandla immun avvisande, vilket framgår i en modell av terapi eldfasta graft – versus – host sjukdom8. Fostervatten vätska stamceller (hAFS) aktivt berika CM med MVs och Exo, heterogent fördelat i storlek (50-1000 nm), som medlar flera biologiska effekter, såsom spridning av differentierade celler, angiogenes, hämning av fibros, och hjärtfunktionen4. Vi har nyligen visat att EV, och särskilt Exo, utsöndras av mänskliga hjärt-derived stamceller (Exo-CPC) minska hjärtinfarkt storlek i råttor5,9.
EXO dela en gemensam uppsättning proteiner på ytan, inklusive tetraspanins (CD63, CD81, CD9) och stora histocompatibility komplex klass I (MHC-jag). Förutom denna gemensamma uppsättning av proteiner, Exo även innehåller proteiner som är specifika för den EV delmängden av producenten celltyp. EXO markörer vinner avgörande betydelse eftersom de spelar en avgörande roll i mellan cellulär kommunikation, därmed reglera många biologiska processer5,10. På grund av sin storlek, att hitta ett enkelt sätt att analysera EV använder klassiskt flöde flödescytometri (FC) återstår en utmanande uppgift.
Här presenterar vi ett förenklat protokoll för EV analys med FC, som kan tillämpas på pre berikad produktproverna genom ultracentrifugering eller direkt till CM (figur 1). Metoden använder pärlor belagd med en specifik antikropp som binder kanoniska Exo-associerade ytan epitoper (CD63, CD9, CD81) utan ytterligare tvättar. FC analyser kan utföras med en konventionell cytometer utan behov av justeringar innan mätningar. Metoder för karakterisering av antigener på enskilda små partiklar med flöde cytometers har beskrivits av andra grupper med avseende på olika program11,12,13. Här, använde vi functionalized magnetiska pärlor för fångst av små partiklar och Exo, följt av fenotypning av infångade partiklar av FC. Även om denna metod kan användas för att karaktärisera antigena sammansättningen av små blåsor som släpptes av vilken celltyp som in vitro-, gav här vi viss cell kultur villkor som gäller för kulturen av mänskliga hjärt stamceller (CPC) och mest lämplig miljö för produktion av EV av dessa celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konventionella FC teknik är fortfarande den mest okomplicerade analytiska metoden att karakterisera markörer som uttrycks på ytan av EV. I detta sammanhang är välja lämpligaste protokollet avgörande för att få användbar information på enskild partikel fraktioner av intresse genom att undvika begränsningar på grund av instrumentet känslighet. Vi beskrivs en metod med magnetiska partiklar tillsammans med antikroppar som känner igen Exo och små EV ytantigenerna som lämpar sig för efterföljande FC ansökan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Larsson fick stöd av forskningsanslag av Helmut Horten Stiftung och Velux Stiftung, Zürich (Schweiz). G.V. stöddes av forskningsanslag av schweiziska National Science Foundation, Stiftelsen Cecilia-Augusta, Lugano och SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Schweiz)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
Referências
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
