Høj overførselshastighed Siderophore Screening fra miljøprøver: plante væv, Bulk jord og rhizosfære jord
Summary
Vi præsenterer en protokol til hurtig screening af miljøprøver for siderophore potentielle bidrag til mikronæringsstoffer biotilgængelighed og omsætning i jordbaserede systemer.
Abstract
Siderophores (lav-Molekylær vægt metal chelaterende forbindelser) er vigtige i forskellige økologiske fænomen spænder fra jern (Fe) biogeokemiske cykling i jorder, at patogenet konkurrence, plante vækstfremmende og cross-Kongerige signalering. Siderophores er desuden også af kommercielle interesser i bioleaching og bioweathering af metalholdigt mineraler og malme. En hurtig, omkostningseffektiv og robust middel til kvantitativt at vurdere siderophore produktion i komplekse prøver er nøglen til at identificere vigtige aspekter af de økologiske konsekvenser af siderophore aktivitet, herunder, Roman siderophore producerer mikrober. Metoden præsenteres her blev udviklet for at vurdere siderophore aktivitet i takt microbiome Fællesskabers miljøprøver, som jord eller plante væv. Prøverne blev homogeniseret og fortyndes i en modificeret M9 medium (uden Fe), og berigelse kulturer blev udruget i 3 dage. Siderophore produktion blev vurderet i prøver på 24, 48 og 72 timer (h) ved hjælp af en roman 96-brønd mikrotiterplade CAS (Chrome azurol f.eks)-Fe agar assay, en tilpasning af den traditionelt kedelige og tidskrævende kolorimetriske metode til vurdering af siderophore aktivitet, udført på enkelte dyrkede mikrobielle isolater. Vi anvendte vores metode til 4 forskellige genotyper/linjer af hvede (Triticum aestivum L.), herunder Lewjain, Madsen, og PI561725 og PI561727 almindeligt dyrket i indre Pacific Northwest. Siderophore produktion var tydeligt påvirket af genotype hvede og i bestemte typer af plantevæv observeret. Vi har med held brugt vores metode til hurtigt skærmen for anlægget genotype indflydelse på siderophore produktion, en nøglefunktion i terrestriske og akvatiske økosystemer. Vi producerede mange tekniske replikater, giver meget pålidelige statistiske forskelle i jord og i plantevæv. Vigtigere, viser resultaterne den foreslåede metode kan bruges til hurtigt at undersøge siderophore produktion i komplekse prøver med en høj grad af pålidelighed, på en måde, der giver mulighed for lokalsamfund til at blive bevaret for det senere arbejde at identificere taxa og funktionelle gener.
Introduction
Siderophores er vigtige biomolekyler involveret primært i jern-kelation for biotilgængelighed, men med en lang række yderligere formål i terrestriske og akvatiske økosystemer spænder fra mikrobielle quorum sensing, signalering til mikrobiel plante-værter, plante vækstfremmende, samarbejde og konkurrence inden for komplekse mikrobielle samfund1,2. Siderophores kan groft inddeles efter deres aktive steder og strukturelle træk, oprettelse af fire grundlæggende typer: carboxylat, hydroxamate, catecholate, og blandede typer3,4. Mange mikroorganismer er i stand til at udskille mere end én type af siderophore5 og i komplekse samfund, et stort flertal af organismer biosynthesize membranreceptorer at tillade optagelsen af en endnu bredere vifte af siderophores1, 6. Seneste arbejde viser, at siderophores er særligt vigtigt på fællesskabsplan, og selv i Inter Kongerige kommunikation og biogeokemiske overførsler7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol f.eks (CAS) er blevet brugt i over 30 år som en chelatdanner til at binde jern (Fe) på en sådan måde, at tilsætning af ligander (dvs. siderophores) kan resultere i dissociation af CAS-Fe komplekset, skaber en let identificerbare farveskift på mellemlang 12. når the CAS er bundet med Fe, farvestoffet vises som en royal blå farve, og som CAS-Fe kompleks dissocieres, medium skifter farve afhængigt af ligand bruges til at skyllepumpetab Fe13. Den indledende, væskebaseret medium etableret af Schwyn og Neilands i 1987, er blevet ændret på mange måder at imødekomme skiftende mikrobielle mål14, vækst vaner og begrænsninger15, samt en lang række metaller udover Fe, herunder aluminium, mangan, kobolt, cadmium nikkel, lithium, zink16, kobber17, og endda arsen18.
Mange menneskelige patogener, så godt som plant vækst fremme mikroorganismer (PGPM) er blevet identificeret som siderophore-producerende organismer3,19,20, og vigtige rhizosfære og endophytic PGPM ofte teste positivt for siderophore-produktion4. Den traditionelle Fe-baseret flydende metode er blevet tilpasset til mikrotiter afprøvning af isolater i dyrkning for siderophore produktion21. Men disse teknikker undlader at erkende betydningen af den mikrobielle samfund som helhed (microbiome), i samarbejde og potentielle regulering af siderophore produktion i jord og plante systemer22. Derfor har vi udviklet en høj overførselshastighed fællesskabsplan vurdering af siderophore produktion fra et bestemt miljø, baseret på traditionelle CAS analysen, men med replikering, nem måling, pålidelighed og repeterbarhed ved en mikrotiterplade assay.
I denne undersøgelse præsenteres en omkostningseffektiv, høj overførselshastighed CAS-Fe assay til påvisning af siderophore produktion for at vurdere berigelsen af siderophore produktion fra komplekse prøver (dvs. jord og plante væv homogeniseret). Bulk, løst bundet og stramt bundet rhizosfære jord (med hensyn til hvordan jorden var bundet til roden) blev opnået sammen med korn, skyde og root væv fra fire forskellige hvede (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, og PI561727. Det var den hypotese, at grundlæggende forskelle i hvede genotyper kan resultere i forskelle i rekruttering og udvælgelse af siderophore producerer Fællesskaber. Af særlig interesse er forskellen mellem mikrobielle samfund tilknyttet PI561725 isogene linje, som er aluminium tolerante, fordi det besidder ALMT1 (aluminium-aktiveret malat Transporter 1), sammenlignet med aluminium følsomme PI561727 isogene linje, som besidder en ikke-aluminium lydhør form af genet, almt123,24,25,26. Chief formålet med undersøgelsen var at udvikle en enkel, hurtig metode til kvantitativ vurdering af siderophore produktion i siderophore berigelse kulturer af komplekse prøve typer samtidig bevare kulturer for det fremtidige arbejde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det primære resultat af dette arbejde er produktion af en ny metode, der kan bruges til hurtigt berige for siderophore producerer mikrober mens kvantitativt måling siderophore produktion/aktivitet i den miljømæssige prøve. Metoden er hurtig, enkel og omkostningseffektiv, og resultaterne viser, hvordan det kan bruges til at registrere siderophore aktivitet fra komplekse og roman prøve typer (e.g., jord og plante væv). Protokollen også resulterer i produktionen af glycerol lagre af berigelse kulturer, som …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Kalyani Muhunthan for assistance i laboratorieprocedurer, Lee Opdahl for hvede genotype høst, Washington State Concord Grape Research Council og Washington State University Center for opretholdelse af landbrug og Naturlige ressourcer for en BIOAg tilskud til støtte for dette arbejde. Yderligere støtte blev leveret af USDA/NIFA gennem lugen projekt 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
Referências
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
