Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems
Summary
Presenteren we een protocol voor snelle screening van milieu monsters voor siderofoor potentieel bijdragen aan micronutriënt biologische beschikbaarheid en omzet in terrestrische systemen.
Abstract
Siderophores (laag-moleculair gewicht metaal verbindingen chelaat) zijn belangrijk in verschillende ecologische fenomeen variërend van ijzer (Fe) biogeochemische fietsen in de bodem, pathogen competitie, plant groeibevorderaars en cross-Koninkrijk signalering. Bovendien zijn siderophores ook commerciële belangstelling voor bioleaching en bioweathering voor metalen mineralen en ertsen. Een robuuste, snelle en kosteneffectieve middelen van kwantitatief beoordeling siderofoor productie in complexe monsters is de sleutel tot het identificeren van belangrijke aspecten van de ecologische gevolgen van siderofoor activiteit, waaronder, roman siderofoor microben produceren. De methode die hier gepresenteerd is ontwikkeld om de siderofoor activiteiten beoordelen van in-tact microbiome Gemeenschappen, in milieu monsters, zoals grond of plantaardige weefsels. De monsters werden gehomogeniseerd en verdund in een gemodificeerde M9 medium (zonder Fe) en verrijking culturen werden geïncubeerd voor 3 dagen. Siderofoor productie in monsters op 24, 48 en 72 uur (h) met behulp van een roman 96-Wells-microplate CAS (Chrome azurol Boxmark) evalueerden-Fe agar assay, een aanpassing van de traditioneel vervelend en tijdrovend colorimetrische methode voor de beoordeling van siderofoor activiteit, uitgevoerd op afzonderlijke gecultiveerde microbiële isolaten. Wij onze methode aan 4 verschillende genotypen/lijnen van tarwe (Triticum aestivum L.), met inbegrip van Lewjain, Madsen, en PI561725 en PI561727 vaak geteeld in de binnenvaart Pacific Northwest toegepast. Siderofoor productie werd duidelijk beïnvloed door het genotype van tarwe, en met de specifieke soorten plantaardige weefsels waargenomen. We met succes onze methode gebruikt om snel scherm voor de invloed van plant genotype op siderofoor productie, een belangrijke functie in terrestrische en aquatische ecosystemen. Wij geproduceerd vele technische replicaten, opbrengst zeer betrouwbare statistische verschillen in de bodem en in plantaardige weefsels. Nog belangrijker is, blijkt de resultaten dat de voorgestelde methode kan worden gebruikt om snel siderofoor productie in complexe monsters te onderzoeken met een hoge mate van betrouwbaarheid, op een wijze waarmee gemeenschappen te behouden voor latere werk om taxa en functionele genen te identificeren.
Introduction
Siderophores zijn belangrijke biomoleculen betrokken voornamelijk in ijzer-chelatie voor biologische beschikbaarheid, maar met een breed scala van aanvullende doeleinden in terrestrische en aquatische ecosystemen variërend van microbiële quorum sensing, signalering naar microbiële plant-hosts, plant groeibevorderaars, samenwerking en concurrentie binnen de complexe microbiële gemeenschappen1,2. Siderophores kan worden in grote lijnen ingedeeld volgens hun actieve sites en structurele kenmerken, maken van de vier basistypen: carboxylaat, hydroxamate, catecholate, en gemengde typen3,4. Vele micro-organismen kunnen afscheiden van meer dan één type van siderofoor5 en in complexe Gemeenschappen, een overgrote meerderheid van de organismen biosynthesize de membraan receptoren zodat de opname van een nog breder scala aan siderophores1, 6. Recent werk geeft aan dat siderophores met name van belang op communautair niveau, en zelfs in het Koninkrijk van de onderlinge communicatie en biogeochemische overdrachten7,8,9,10 zijn ,11.
Chroom azurol Boxmark (CAS) is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een chelaatvormer te binden ijzer (Fe) op een zodanige wijze dat toevoeging van liganden (bijvoorbeeld siderophores) leiden dissociatie van het CAS-Fe-complex tot kan, het creëren van een herkenbaar kleurverandering in het medium 12. Wanneer de CAS is gebonden met Fe, de kleurstof wordt weergegeven als een Koninklijk blauwe kleur, en als de CAS-Fe-complex distantieert, het medium verandert van kleur afhankelijk van de soort ligand gebruikt voor het opruimen van de Fe-13. Het medium van het oorspronkelijke, op vloeistof gebaseerde opgericht door Schwyn en Neilands in 1987, is gewijzigd in veel opzichten voor wijzigen van microbiële doelstellingen14, groei gewoonten en beperkingen15, evenals een verscheidenheid van metalen naast Fe, met inbegrip van aluminium, mangaan, kobalt, cadmium, nikkel, lithium, zink16, koperen17en zelfs arseen18.
Veel menselijke pathogenen, zo goed als plant groei bevorderen van micro-organismen (PGPM) zijn geïdentificeerd als siderofoor-producerende organismen3,19,20, en belangrijke rhizosfeer en endophytic PGPM vaak testen positief voor siderofoor-productie4. De traditionele Fe-gebaseerde vloeibare methode is aangepast aan de microtiterplaat testen van isolaten in teelt voor siderofoor productie21. Echter deze technieken niet om te erkennen het belang van de microbiële Gemeenschap als geheel (de microbiome), in samenwerking en mogelijke regulering van de productie van siderofoor in bodem en plant systemen22. Om die reden hebben we een high-throughput Gemeenschapsniveau beoordeling van de siderofoor productie van een bepaald milieucompartiment, gebaseerd op de traditionele CAS assay, maar met replicatie, gebruiksgemak meting, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid in een microplate assay.
In deze studie is een kosteneffectieve, hoge-doorvoer CAS-Fe-assay voor het opsporen van siderofoor productie bedoeld om te beoordelen van de verrijking van de siderofoor productie van complexe monsters (dat wil zeggen, bodem en plant weefsel homogenates). Bulk, losjes-gebonden en strak gebonden rhizosfeer bodem (in termen van hoe de bodem was gebonden aan de wortel) samen met graan, schieten en wortel weefsels uit vier verschillende tarwe (Triticum aestivum L.) genotypen werden verkregen: Madsen, Lewjain, PI561725, en PI561727. Het was veronderstelde dat fundamentele verschillen in de genotypen van tarwe kunnen leiden tot verschillen in werving en selectie van siderofoor productie van gemeenschappen. Van bijzonder belang is het verschil tussen microbiële gemeenschappen die zijn gekoppeld aan de isogene lijn van PI561725, die is aluminium tolerant omdat het bezit ALMT1 (aluminium-geactiveerde Malate Transporter 1), in vergelijking met de aluminium gevoelige PI561727 isogene lijn, die beschikt over een niet-aluminium responsieve vorm van het gen, almt123,24,25,26. Het hoofddoel van de studie was een eenvoudige, snelle methode van het kwantitatief beoordeling van productie van het siderofoor in siderofoor verrijking culturen van complexe monster typen met behoud van de culturen voor toekomstige werkzaamheden te ontwikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belangrijkste resultaat van dit werk is de productie van een nieuwe methodologie die kan worden gebruikt om snel verrijken siderofoor microben produceren tijdens het kwantitatief meten van siderofoor productie/activiteit in het milieu monster. De methodologie is snel, eenvoudig en kosteneffectief, en de resultaten laten zien hoe het kan worden gebruikt voor het detecteren van siderofoor activiteit van complexe en nieuwe monster typen (b.v.., bodem en plant weefsel). Het protocol ook resulteert in de producti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Kalyani Muhunthan voor hulp bij het laboratorium procedures, Lee Opdahl voor het oogsten van tarwe-genotype, de Washington State Concord druif Research Council en de Washington State University Center voor duurzame landbouw en Natuurlijke middelen voor een BIOAg verlenen om dit werk te ondersteunen. Aanvullende financiering werd verstrekt door de USDA/NIFA via Hatch-project 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
Referências
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
