환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

Summary

우리는 지구 시스템에서 미 량 영양소 bioavailability 및 매출에 기여 하는 siderophore 잠재적인 환경 샘플의 신속한 심사에 대 한 프로토콜을 제시.

Abstract

Siderophores (저 분자 무게 금속 화합물을 킬레이트 화) 병원 체 경쟁, 식물 성장 촉진, 그리고 크로스 왕국 신호를 토양에 철 (Fe) 생물 지구 화학적 순환에서 배열 하는 다양 한 생태 현상에 중요 하다. 또한, siderophores bioleaching 및 베어링 금속 광물 및 광 석의 bioweathering에 상업적인 관심 있습니다. 양적 평가에서 복잡 한 샘플 siderophore 생산의 급속 한, 비용 효과적이 고 강력한 수단 siderophore 활동을 포함 하 여, 소설 siderophore 생산 하는 미생물의 생태 파급 효과의 중요 한 측면을 식별 하는 키입니다. 여기에 제시 된 방법 siderophore 토양 또는 식물 조직 같은 환경 샘플에서 전술에 미생물 커뮤니티의 활동을 평가 하기 위해 개발 되었다. 샘플 했다 균질 하 고 (Fe), 없이 수정 된 M9 매체에 희석 농축 문화 3 일 동안 알을 품을 했다. Siderophore 생산에 24, 48, 및 72 시간 (h) 소설 96 잘 microplate CAS (크롬 azurol 성의)를 사용 하 여 샘플에 평가 되었다-Fe agar 분석 결과, siderophore 평가의 전통적으로 지루하고 시간이 많이 걸리는 색도계 방법의 적응 활동, 개별 재배 미생물 분리에 수행입니다. 우리 밀 (Triticum aestivum L.)의 4 가지 genotypes/라인, Lewjain, PI561725, 매드 슨, 그리고 내륙 평화로운 북 서에서 일반적으로 성장 하는 PI561727를 포함 하 여 우리의 방법을 적용. Siderophore 생산은 명확 하 게 밀, 및 식물 조직 관찰의 특정 종류는 유전자 형에 의해 영향을. 우리는 성공적으로 빠르게 siderophore 생산, 지상파와 수생 생태계에 핵심 기능 식물 유전자의 영향에 대 한 화면을 우리의 방법 사용. 우리는 매우 신뢰할 수 있는 통계적 차이가 토양 및 식물 조직 내의 저조한 많은 기술 복제, 제작. 중요 한 것은, 결과 보여 빠르게 taxa 및 기능성 유전자를 확인 후 작업 보존 사회를 허용 하는 방식으로 신뢰성의 높은 학위를 가진 복잡 한 샘플에서 siderophore 생산을 검토 하는 제안 된 메서드를 사용할 수 있습니다.

Introduction

Siderophores는 중요 한 생체 철 chelation bioavailability, 하지만 다양 한 미생물 쿼럼 감지, 미생물 공장-호스트, 신호에서 배열 하는 지상파와 수생 생태계에 추가적인 목적에 주로 관여 식물 성장 촉진, 협력 및 복잡 한 미생물 지역 사회^1,2내 경쟁. Siderophores 분류할 수 있습니다 광범위 하 게 그들의 활성 사이트 및 구조 기능, 4 개의 기본 형식 만들기: 카복실산, hydroxamate, catecholate, 및 종류^3,4혼합. 많은 미생물 검출 한 종류 이상의 siderophore⁵ 및 복잡 한 사회, 생물 biosynthesize의 대부분에서에서 막 수용 체 siderophores^{1의 더 넓은 다양 한의 통풍 관을 허용 하도록 할 수 있다 6}. 최근 작품이 나타냅니다 siderophores는 특히 중요 한 지역 사회 수준에 남북 왕국 통신 및 생물 지구 화학적 전송^{7,,89,10에도 ,11}.

크롬 azurol 반발 (CA) 사용 되었습니다 chelating 요원으로 30 년 이상 철 (Fe)에 바인딩할 CAS Fe 복잡 한 매체에 쉽게 식별 색상 변화를 만들기의 분리에 ligands (즉, siderophores)의 추가 발생할 수 있습니다 같은 방법으로 ¹². 때에 CAS Fe와 바인딩되어, 염료 로얄 블루 색상으로 나타납니다 및 CAS Fe 복잡 한 분리, 매체 Fe¹³를 청소 하는 데 사용 하는 리간드의 종류에 따라 색상 변경. 1987 년, Schwyn 및 Neilands에 의해 설립 초기, 액체 기반 매체 미생물 대상¹⁴, 성장 습관과 제한¹⁵, 뿐만 아니라 금속 철, 외의 다양 한 변화를 수용 하기 위해 여러 가지에서 수정 되었습니다 포함 하 여 알루미늄, 망간, 코발트, 니켈 카드뮴, 리튬, 아연¹⁶, 구리¹⁷, 그리고 심지어 비소¹⁸.

많은 인간 병원 체, 뿐만 아니라 식물 성장 촉진 미생물 (PGPM)로 확인 되었습니다 siderophore 생산 생물^3,,1920및 중요 한 rhizosphere와 종종 테스트 endophytic PGPM 긍정적인 siderophore 생산⁴. 전통적인 철 기반 액체 방법은 결정 격리 재배 siderophore 생산²¹의 테스트에 적응 되었습니다. 그러나, 이러한 기술을 전체 (미생물), 협력에 미생물 커뮤니티의 중요성 및 토양 및 식물 시스템²²siderophore 생산의 잠재적인 규칙을 인식 하지. 그 이유로, 우리는 siderophore 생산 기반으로 전통적인 CAS 분석 결과, 하지만 복제, 측정, 안정성 및 반복성을 microplate에의 용이성, 주어진된 환경에서의 높은 처리량 커뮤니티 수준 평가 개발 분석 결과입니다.

이 연구에서는 siderophore 생산을 탐지 하기 위한 비용, 높은 처리량 CAS Fe 시험 siderophore 생산에서 복잡 한 샘플 (즉, 토양 및 식물 조직 homogenates)의 농축을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 대량, 느슨하게 연결, 그리고 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 조건 (어떻게 토양 루트 였던) 곡물, 촬영, 및 4 개의 뚜렷한 밀 (Triticum aestivum L.) genotypes에서 루트 조직 취득 했다: Lewjain, 매드 슨, PI561725, 그리고 PI561727입니다. 그것은 밀 genotypes 근본적인 차이 모집 및 다양 한 커뮤니티를 생산 하는 siderophore에 차이가 발생할 수 있다는 가설 했다. 특정 관심의 이다 미생물 지역 사회는 관대 알루미늄 ALMT1 (Malate 전송 1 알루미늄 활성화)를가지고 있기 때문에, PI561725 isogenic 선, 연관의 차이와 비교 알루미늄 중요 한 PI561727 isogenic 선, 유전자, almt1^23,,2425,26의 비-알루미늄 반응 형태를 소유 하는. 연구의 주요 목적은 미래의 일에 대 한 문화를 유지 하면서 복잡 한 샘플 형식의 siderophore 농축 문화에서 siderophore 생산 양적 평가의 간단한, 빠른 방법 개발 했다.

Protocol

참고: 필드 사이트의 위치: 워싱턴 주립 대학, 식물 병 리 농장 (46 ° 46’38.0 “N 117 ° 04’57.4” W). 씨앗은 기계적인 화분을 사용 하 여 10 월 19 일, 2017에 뿌린 씨. 각 밀 유전자 headrows, 대략 1 미터 떨어져 루트 시스템의 중복을 피하기 위해 심은 했다. 식물 및 토양 샘플 2018 년 8 월 9 일 때 식물은 추수에 대 한 준비에 수집 되었다. 샘플 4 밀 genotypes의 3 개의 복제에서 모았다: PI561727, PI561725, 매드 슨, Lewjain.<…

Representative Results

슈 도모 나 스 fluorescens 에 의해 pyoverdine 혼합물 biosynthesized 해석 하 고 흡 광도 측정 하는 표준으로 사용 되었다 (에서 420 nm) µ M. pyoverdine 해당 점에서 샘플의 그림 1 흡 광도 (420 사이 관계를 보여 줍니다. nm) 및 pyoverdine (µ M에서 로그10 몰)의 농도 시작. EDTA 샘플 전시 큰 흡 광도 측정 보다 R2 와 pyoverdine, 달성 했다 (<strong class="xfig…

Discussion

이 작품의 기본 결과 양적 siderophore 생산/환경 샘플에서 활동을 측정 하는 동안 미생물을 생산 하는 siderophore에 대 한 신속 하 게 풍부 하 게 사용할 수 있는 새로운 방법론의 생산 이다. 방법론은 빠르고, 단순 하 고 비용 효율적인, 그리고 결과 사용 하 수 있는 복잡 하 고 소설 샘플 형식에서 siderophore 활동을 탐지 하는 방법을 보여 줍니다 (예를 들어., 토양 및 식물 조직). 프로토콜 또한 농?…

Materials

Agarose	Apex	LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular	Fiesher Scientific	152315A
Autoclave and Sterilizer	Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate	Fiesher Scientific	171428
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder	Fiesher Scientific	1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal	J.T.Baker	JI2476
Glycerol, Anhydrous	Baker Analyzed	C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide	Reagent World	FZ0941
Hydrochloride acid	ACROS Organic	B0756767
Infinite M200 PRO plate reader	TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99%	ACROS Organic	A0342179
Laboratory Fume Hood	Thermo Scientific
Laboratory Incubator	VWR Scientific
Magnesium Sulfate	Fiesher Scientific	27855
Niric Acid, (69-70)%	J.T.Baker	72287
PIPES buffer, 98.5%	ACROS Organic	A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder	J.T.Baker	J48594
Pyoverdine	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
Sand
SI-600R Shaker	Lab Companion
Sodium chloride, granular	Fiesher Scientific	136539
Sodium hydroxide, pellets	J.T.Baker	G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%	ACROS Organic	A0371705