Method Article

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

DOI:

10.3791/59143

⸱

February 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

In This Article

Summary

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Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.

Abstract

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Circulantes e intersticiais pequenas membrana-limite extracelulares vesículas (EVs) representam alvos promissores para o desenvolvimento de ensaios de romance biomarcador de diagnóstico ou prognóstico e provavelmente servem como jogadores importantes na progressão de um vasto espectro de doenças. A pesquisa atual está focada na caracterização das vesículas secretada de várias células e tipos de tecido para melhor entendem o papel do EVs na patogênese das condições incluindo neurodegeneração, inflamação e câncer. No entanto, técnicas globalmente consistentes e reproduzíveis para isolar e purificar vesículas permanecem em andamento. Além disso, métodos para extração de EVs de tecido sólido ex vivo são raramente descritos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para extrair pequenas EVs de interesse de tecidos inteiros frescos ou congelados, incluindo amostras de cérebro e tumor, para caracterização mais. Vamos demonstrar a capacidade de adaptação desse método para múltiplas análises a jusante, incluindo microscopia eletrônica e caracterização imunofenotípica das vesículas, bem como, a espectrometria de massa quantitativa de proteínas EV.

Introduction

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Pequenas vesículas extracelulares (EVs) incluem CDDP-derivado exosomes e pequenas aumentada de membrana-galpão de amplo interesse biomédico. EVs pequenas são compostas por uma população heterogénea das vesículas de membrana-limite nm 50-250 contendo proteínas biologicamente activas, lípidos e ácidos nucleicos que coletivamente são acreditados para desempenhar um papel importante em uma infinidade de processos da doença. Fazer avançar a pesquisa implicou particularmente essas vesículas em neurodegenerativas e doenças de príon, processos infecciosos, condições auto-imunes ou inflamatórias e crescimento do tumor e metástases1,

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Protocol

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Todo cérebro foram obtido com a aprovação do uso institucional do Animal e cuidados Comissão (IACUC) da Universidade do estado da Flórida. Um total de doze cérebro de rato (3 cérebros de cada grupo de idade: 2, 4, 6 e 8 meses) de um J C57BL/6 fundo foram usadas para a extração de EV, como descrito anteriormente,16. Amostras de tumor de pulmão foram generosamente doadas pelo Dr. Mandip Sachdeva sob aprovação da Flórida agrícola e mecânica IACUC Universidade. Tumores de pulmão foram derivados a linhagem de células de adenocarcinoma humano H1975 cultivada em imunodeficientes Balb/c nu/nu camundongos. Dados de duas repetições de tumor representativ....

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Results

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Uma visão esquemática da dissociação de tecido, centrifugação diferencial e gradiente purificação das vesículas é exibida na Figura 1. Morfológica e imunofenotípica confirmação da gradiente-purificado EVs é destacada na Figura 2. Um diagrama de densidades pode ser reproduzidos após ultracentrifugação do gradiente iodixanol 10-30% é mostrado, com duas populações distintas de vesículas migrando para cima a fração 2 (luz EVs) e fraç.......

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Discussion

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Gerou-se interesse muito científico com relação os papéis que pequenos EVs jogar o microambiente do tumor, bem como na função, maturação e desenvolvimento do órgão. Em geral, este estudo fornece um fluxo de trabalho otimizado para a extração de EVs intactas de todo o cérebro ou espécimes do tumor. Enquanto aqui estamos simplesmente demonstrar a aplicabilidade desta técnica para EVs derivado de tumor de pulmão, esse método poderia facilmente ser adaptado para trabalhar em outros tecidos sólidos, proporcionando oportunidad.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Os autores Obrigado Dr. Richard Nowakowski e os recursos da Flórida estado Universidade laboratório Animal para fornecer e cuidando de animais utilizados para desenvolver este protocolo, respeitosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e o Florida estado Universidade translacional Science Laboratory para assistência com o trabalho de espectrometria de massa utilizado para caracterização de vesículas a jusante, bem como a facilidade de FSU biológica ciência Imaging Resource para o uso do microscópio eletrônico de transmissão neste estudo. Finalmente, agradecemos o Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pela doação dos espécimes tumor utilizada no desenv....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,45 µ filtro mVWR28145-505
tubos de ultracentrífuga de 12 mLBeckman Coulter331372
tubos de ultracentrífuga de 5,5 mLBeckman Coulter
anticorpo anti-AlixSanta Cruzsc-7129
anticorpo anti-CalnexinaSanta Cruzsc-11397
anticorpo anti-CD63Abcamab59479
anti-CD81 anticorpoSanta Cruzsc-9158
anti-Flotilina 2 anticorpoSanta Cruzsc-25507
anti-HSC70 anticorpoSanta Cruzsc-7298
anti-Syntenin-1 anticorpoSanta Cruzsc-100336
anti-TSG101 anticorpoSanta Cruzsc-7964
EZQ kit de quantificação de proteínasThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 rotor Eppendorf5820715006
FEI CM120 Microscópio EletrônicoTSS Microscopia
cabra anti-coelho IgG (fragmento Fab)Genetex27171
HALT inibidor de fosfatase (solução 100x)ThermoFisher Scientific78420
HALT inibidor de protease (solução 100x)ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E mediumThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 rotor de balde oscilanteBeckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Ultracentrífuga de Bancada Ultracentrífuga Beckman Coulter393315
Optima XE-100Beckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% iodixanol em solução aquosa estéril
Q Exactive HF Mass SpectrometerThermoFisher Scientific
coelho anti-cabra IgGGenetex26741
coelho anti-rato IgGGenetex26728
Refracto 30PX (refratômetro)Mettler Toledo51324650
S-4-104 rotorEppendorf5820759003
SW 41 Ti balde oscilante RotorBeckman Coulter333790
Centrífuga de mesa 5804REppendorf22623508
344057

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.

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