Beredning av svamp och växtmaterial för strukturella klarläggande använder dynamisk nukleära polarisering Solid-State NMR

Summary

Ett protokoll för att förbereda ¹³C,¹⁵N-märkt svamp och växt prover för flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi och dynamiska nukleära polarisering (DNP) undersökningar presenteras.

Abstract

Detta protokoll visar hur jämnt ¹³C, ¹⁵N-märkt svamp material kan produceras och hur dessa mjuka material bör fortsättas för solid-state NMR och utökad känslighet DNP experiment. Till exempel förädling av växtbiomassa är också detaljerade. Denna metod tillåter mätning av en rad 1D och 2D ¹³C –¹³C /¹⁵N korrelationer spectra, som möjliggör högupplöst strukturella förtydligandet av komplexa biomaterial i sitt ursprungliga tillstånd, med minimal störning. Isotop-märkning kan granskas av kvantifiera intensiteten i 1D spectra och polarisering spruttryck i 2D korrelation spectra. Framgången för dynamisk nukleära polarisering (DNP) provberedning kan utvärderas av den känslighet enhancement faktorn. Ytterligare experiment att undersöka de strukturella aspekterna av polysackarider och proteiner leder till en modell av den tredimensionella arkitekturen. Dessa metoder kan ändras och anpassas för att undersöka en rad olika kolhydratrika material, inklusive naturliga cellväggarna i växter, svampar, alger och bakterier, samt syntetiserade eller utformade kolhydratpolymerer och deras komplex med andra molekyler.

Introduction

Kolhydrater har en central roll i olika biologiska processer som energilagring, strukturella byggnad, och cellulära erkännande och vidhäftning. De är berikade i cellväggen, som är en grundläggande komponent i växter, svampar, alger och bakterier^1,2,3. Cellväggen fungerar som en central källa för produktion av biobränsle och biomaterial, samt en lovande måltavla för antimikrobiella terapier^{4,5,6,7,8 , 9}.

Den samtida förståelsen av dessa komplexa material har tidigarelagts väsentligen av decenniers ansträngningar som ägnades åt strukturella karakterisering med fyra stora biokemiska eller genetiska metoder. Den första stora metoden bygger på sekventiella behandlingar med starka kemikalier eller enzymer bryta ner cellväggarna i olika delar, som följs av sammansättning och länkage analys av socker i varje bråkdel¹⁰. Denna metod belyser domän fördelningen av polymerer, men tolkningen kan vara missvisande på grund av de kemiska och fysikaliska egenskaperna av biomolekyler. Exempelvis är det svårt att avgöra huruvida den alkali-extraherbara fraktionen härstammar från en enda domän av mindre strukturerade molekyler eller rumsligt separerade molekyler med jämförbara löslighet. Andra, den extraherade delar eller hela cellväggar kan också mätas med hjälp av lösning NMR för att bestämma kovalenta kopplingarna, också betecknas som crosslinking, mellan olika molekyler^{11,12,13, 14,15}. På detta sätt kovalent ankare detaljerad struktur kunde bli utforskad, men begränsningar kan finnas på grund av den låga lösligheten av polysackarider, det relativt lilla antalet crosslinking platser och okunnighet om icke-kovalenta effekter som stabiliserar polysackarid packning, inklusive väte-limning, van der Waals kraften, elektrostatiska växelverkan och polymer entanglement. Tredje, affinitet har varit beslutsam i vitro med isolerade polysackarider^16,17,18,19, men rening förfaranden kan väsentligt förändra struktur och egenskaper hos dessa biomolekyler. Denna metod underlåter också att replikera den sofistikerade nedfall och sammansättningen av makromolekyler efter biosyntes. Slutligen den fenotyp, cellmorfologi och mekaniska egenskaper av genetiska mutanter med försvagat produktion av vissa cellväggen komponent kasta ljus på de strukturella funktionerna av polysackarider, men mer molekylära bevis behövs för att överbrygga dessa makroskopiska observationer med funktionen konstruerad av protein maskinerier²⁰.

Senaste framstegen inom utveckling och tillämpning av flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi har infört en unik möjlighet för att lösa dessa strukturella pussel. 2D/3D solid-state NMR-experimenten aktivera högupplösta utredning av sammansättningen och arkitekturen av kolhydratrika material i native staten utan större störningar. Strukturella studier har genomförts framgångsrikt på både primära och sekundära cellväggar av växter, katalytiskt behandlade biomassa, bakteriell biofilm, pigmentet spöken i svampar och nyligen av författarna, intakta cellväggar i en patogen svamp Aspergillusfumigatus ^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31}. utvecklingen av dynamiska nukleära polarisering (DNP)^{32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42} underlättar väsentligt NMR strukturella förtydligandet som känslighet förbättrande av DNP förkortar markant experimentella tiden på dessa komplexa biomaterial. Protokollet beskrivs här information om förfarandena för isotopen-märkning svampen A. fumigatus och förbereda svamp och växtprover för solid-state NMR och DNP karakterisering. Liknande märkning förfaranden bör vara tillämplig på andra svampar med förändrad medium, och prov förberedelse förfarandena bör vara allmänt tillämpliga på andra kolhydratrika biomaterial.

Protocol

1. tillväxt av 13C, 15N-märkt Aspergillusfumigatus flytande Medium Beredning av omärkta och 13C, 15N-märkt odlingsmediumObs: Både jäst extrakt pepton dextros medium (YPD) och den förbättra minimal medium43 användes för underhåll av svamp kultur. Alla steg efter autoklavering utförs i en LAF att minimera kontaminering. Beredning av omärkta flytande medium: lös 6,5 g YPD pulver i 100 mL destillerat vatten och se…

Representative Results

Isotopen märkning avsevärt förbättrar NMR känslighet och gör det möjligt för mäta en serie 2D 13C -13C och 13C -15N korrelation spectra att analysera den sammansättning, återfuktning, rörlighet och packning av polymerer, som kommer att integreras för att konstruera en tredimensionell modell av cellväggen arkitekturen (figur 1). Om enhetlig märkning lyckas, en komplett uppsättning 1D 13C oc…

Discussion

Jämfört med de biokemiska metoderna, har solid-state NMR fördelar som en icke-förstörande och högupplösande teknik. NMR är också kvantitativa sammansättning analys, och till skillnad från de flesta andra analysmetoder, gör inte har osäkerheten introducerades av biopolymerer begränsad löslighet. Inrättandet av det nuvarande protokollet underlättar framtida studier på kolhydratrika biomaterial och functionalized polymerer. Det bör dock noteras att resonans tilldelning och dataanalys kan vara tidskrävand…

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
Analytical weighing balance	Ohaus	B730439218	Model PA84C
Bioclave 16 L	VWR	470230-598
Biosafety Cabinet	Labconco corporation	302319100
Boric acid	VWR	BDH9222	store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate	Honeywell|Fluka	60820	≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	BDH	BDH9312	≥98 %
Corning LSE shaking incubator	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99.9 atom % D
d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99.9 atom % D
d8-glycerol	Sigma Aldrich	447498	≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa	Sigma Aldrich	D2272	132724
Dipotassium Phosphate	VWR	BDH9266	≥98 %
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fischer Scientific	750004271	Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit	Bruker	B4493	Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	14498	≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate	VWR	10034998	store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate	Alfa Aesar	11563	≥99 %
Monopotassium Phosphate	VWR	470302-254	≥99 %
pH Meter	Mettler Toledo	B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate	Acros Organics	13235-36-9	≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	33399	≥98 %
12C3, d8-glycerol	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose	Sigma Alrdrich	364606	≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate	Sigma Aldrich	364606	≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor	Cortecnet	B6939
3.2 mm Silicone plug	Bruker	B7089
4 mm MAS Rotor Kit	Bruker	H14355	Zirconia