Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica
Summary
Se presenta un protocolo para preparar 13C,15marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).
Abstract
Este protocolo muestra cómo uniformemente 13C, 15N etiquetado materiales fungicidas pueden ser producidos y experimentos de cómo estos materiales blandos deben ser procedidos para NMR de estado sólido y la sensibilidad mejorada del DNP. También se detalla el procedimiento de procesamiento de las muestras de biomasa vegetal. Este método permite la medición de una serie de 1D y 2D 13C –13C / espectros de correlaciones de15N, que permite alta resolución elucidación estructural de complejos biomateriales en su estado natal, con la mínima perturbación. El isótopo de etiquetado puede ser examinado mediante la cuantificación de la intensidad en espectros 1D y la eficacia de la transferencia de polarización en espectros de correlación 2D. El éxito de la preparación de la muestra de la polarización nuclear dinámica (DNP) puede ser evaluado por el factor de mejora de la sensibilidad. Otros experimentos examinando los aspectos estructurales de los polisacáridos y las proteínas dará lugar a un modelo de la arquitectura tridimensional. Estos métodos pueden ser modificados y adaptados para investigar una amplia gama de materiales ricos en hidratos de carbono, incluyendo las paredes de la célula naturales de plantas, hongos, algas y bacterias, así como sintetizados o diseñado polímeros de hidratos de carbono y su complejo con otros moléculas.
Introduction
Hidratos de carbono juegan un papel central en varios procesos biológicos tales como almacenamiento de energía, construcción estructural y reconocimiento celular y adhesión. Se enriquecen en la pared celular, que es un componente fundamental en plantas, hongos, algas y bacterias1,2,3. La pared celular sirve como una fuente central para la producción de biocombustibles y biomateriales, así como un objetivo prometedor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.
La comprensión contemporánea de estos materiales complejos se ha avanzado sustancialmente por décadas de esfuerzos que se dedicaron a la caracterización estructural mediante cuatro principales métodos bioquímicos o genéticos. El primer método principal se basa en tratamientos secuenciales usando productos químicos fuertes o enzimas para romper las paredes celulares en diferentes porciones, que es seguida de composición y análisis del acoplamiento de los azúcares en cada fracción de10. Este método arroja luz sobre la distribución del dominio de los polímeros, pero la interpretación puede ser engañosa debido a las propiedades químicas y físicas de las biomoléculas. Por ejemplo, es difícil determinar si la fracción extraíble de álcali origina de un solo dominio de moléculas menos estructurados o de moléculas espacialmente separadas con solubilidad comparable. En segundo lugar, las porciones extraídas o toda las paredes celulares puede también medirse usando la solución NMR para determinar la vinculación covalente, denominada también como entrecruzamiento entre moléculas diferentes11,12,13, 14,15. De esta manera, la detallada estructura de covalentes anclajes podría ser sondada, pero pueden existir limitaciones debido a la baja solubilidad de los polisacáridos, el relativamente pequeño número de sitios de entrecruzamiento y la ignorancia de los efectos no covalente que estabiliza embalaje de polisacáridos, incluyendo la vinculación de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, interacción electrostática y enredo de polímero. En tercer lugar, la afinidad ha sido determinado en vitro usando polisacáridos aislados16,17,18,19, pero la purificación procedimientos pueden alterar sustancialmente la estructura y propiedades de estas biomoléculas. Este método también es incapaz de replicar la deposición sofisticada y montaje de macromoléculas después de biosíntesis. Finalmente, el fenotipo, la morfología celular y propiedades mecánicas de los mutantes genéticos con producción atenuada de cierto componente de la pared celular arrojan luces sobre las funciones estructurales de los polisacáridos, pero se necesitan pruebas más molecular para estos observaciones macroscópicas con la función de ingeniería de proteína maquinarias20.
Los recientes avances en el desarrollo y aplicación de la espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional han introducido una oportunidad única para resolver estos rompecabezas estructurales. Experimentos de NMR estado sólidos 2D/3D permiten la investigación de alta resolución de la composición y arquitectura de materiales ricos en hidratos de carbono en el estado nativo sin mayor perturbación. Se han realizado con éxito estudios estructurales en primaria y pared celular secundaria de las plantas, la biomasa tratada catalíticamente, biofilm bacteriano, el pigmento fantasmas en hongos y, recientemente por los autores, las paredes celulares intactas en un hongo patógeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. el desarrollo de la polarización nuclear dinámica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita la elucidación estructural de NMR como la mejora de la sensibilidad por DNP notablemente acorta el tiempo experimental de estos biomateriales complejo. El protocolo descrito aquí detalla los procedimientos para el hongo a. fumigatus de isótopo-etiquetado y preparación de hongos y plantas muestras de estado sólido caracterización NMR y DNP. Similares procedimientos de etiquetado debe ser aplicable a otros hongos con medio alterado, y los procedimientos de preparación de la muestra deben ser generalmente aplicables a otros biomateriales ricos en hidratos de carbono.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con los métodos bioquímicos, NMR de estado sólido tiene ventajas como una técnica no destructiva y de alta resolución. NMR es también cuantitativa en el análisis compositivo, y a diferencia de la mayoría otros métodos analíticos, no han las incertidumbres introducidas por la solubilidad limitada de los biopolímeros. Establecimiento del protocolo actual facilita futuros estudios sobre biomateriales ricos en hidratos de carbono y polímeros funcionalizados. Sin embargo, debe señalarse que el an?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por National Science Foundation a través de OIA NSF-1833040. El laboratorio nacional de campo magnético alto (NHMFL) es apoyado por la National Science Foundation a través del DMR-1157490 y el estado de Florida. El sistema MAS-DNP en el NHMFL es financiado en parte por los NIH S10 OD018519 y NSF CHE-1229170.
Materials
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Acros Organics | 12054-85-2 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P002 | |
| Analytical weighing balance | Ohaus | B730439218 | Model PA84C |
| Bioclave 16 L | VWR | 470230-598 | |
| Biosafety Cabinet | Labconco corporation | 302319100 | |
| Boric acid | VWR | BDH9222 | store at 15-30 °C |
| Cobalt(II) Chloride Hexahydrate | Honeywell|Fluka | 60820 | ≥98 % |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | BDH | BDH9312 | ≥98 % |
| Corning LSE shaking incubator | Thermo Fisher Scientific | 7202152 | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | 99.9 atom % D |
| d6-DMSO | Sigma Aldrich | 151874 | 99.9 atom % D |
| d8-glycerol | Sigma Aldrich | 447498 | ≥99 atom % D |
| Dialysis tubing 3.2 kDa | Sigma Aldrich | D2272 | 132724 |
| Dipotassium Phosphate | VWR | BDH9266 | ≥98 % |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | ≥99.5 % |
| Heraus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 750004271 | Maximum RCF 25,830 x g |
| HR-MAS Disposable Insert Kit | Bruker | B4493 | Kel-F |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 14498 | ≥99+ % |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | VWR | 10034998 | store at 18-26 °C |
| Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Alfa Aesar | 11563 | ≥99 % |
| Monopotassium Phosphate | VWR | 470302-254 | ≥99 % |
| pH Meter | Mettler Toledo | B706689216 | |
| Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | Acros Organics | 13235-36-9 | ≥99.5 % |
| Zinc Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 33399 | ≥98 % |
| 12C3, d8-glycerol | Cambridge Isotope Laboratory | CDLM-8660 | 12C3, 99.95%; D8, 98% |
| 13C6-glucose | Sigma Alrdrich | 364606 | ≥99 % (CP) |
| 15N-sodium nitrate | Sigma Aldrich | 364606 | ≥98 % 15N, ≥99 (cp) |
| 3.2 mm sapphire NMR rotor | Cortecnet | B6939 | |
| 3.2 mm Silicone plug | Bruker | B7089 | |
| 4 mm MAS Rotor Kit | Bruker | H14355 | Zirconia |
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