Aftagne blad analyser for at forenkle genekspression undersøgelser i kartoffel under infestation ved at tygge insekt Manduca Sexta
Summary
Den præsenterede metode skaber naturlige planteædende beskadigede plante vævet gennem anvendelse af manduca Sexta larver til fritliggende blade af kartoffel. Planten væv er analyseret for udtryk for seks transkriptionsfaktor homologer involveret i tidlige reaktioner på insekt herbivory.
Abstract
Den multitrofiske natur af genekspression undersøgelser af insekt æderne kræver et stort antal biologiske replikater, hvilket skaber behovet for enklere, mere strømlinede æderne protokoller. Perturbationer af gnavende insekter undersøgt normalt i hele plantesystemer. Mens hele denne organisme strategi er populær, er det ikke nødvendigt, hvis lignende observationer kan replikeres i en enkelt fritliggende blad. Forudsætningen er, at de grundlæggende elementer, der kræves for signaltransduktion, er til stede i selve bladet. I tilfælde af tidlige begivenheder i signaltransduktion, behøver cellerne kun at modtage signalet fra perturbationen og sende signalet til tilstødende celler, som er analyseret for genekspression.
Den foreslåede metode blot ændrer timing af løsrivelse. I hele planten eksperimenter, larver er begrænset til et enkelt blad, som i sidste ende løsrevet fra planten og analyseret for genekspression. Hvis rækkefølgen af excision er vendt, fra sidste i hele planten undersøgelser, at først i den fritliggende undersøgelse, fodring eksperiment forenkles.
Solanum tuberosum var. Kennebec er formeret ved knude overførsel i et simpelt vævskultur medium og overføres til jord for yderligere vækst, hvis det ønskes. Bladene er fjernet fra moderplanten og flyttet til Petri skåle, hvor foder analysen udføres med larvestadierne i M. Sexta. Beskadiget blad væv er analyseret for ekspression af relativt tidlige begivenheder i signaltransduktion. Genekspression analyse identificerede infestation-specifikke Cys2-His2 (C2H2) transkriptionsfaktorer, bekræfter succesen med at bruge fritliggende blade i tidlig respons undersøgelser. Metoden er lettere at udføre end hele planten angreb og bruger mindre plads.
Introduction
Herbivory sætter i gang en række molekylære begivenheder, hvor en plante kan både identificere angrebet og montere en passende respons for dens overlevelse. Et anlæg modtager to grundlæggende signaler fra gnavende insekter; en fra den fysiske beskadigelse af vævet og den anden fra insekt-specifikke stoffer. Skade-associerede molekylære mønstre (DAMPs) frigives som reaktion på skader skabt af larve munddele og udløse en veldefineret sårrespons, der resulterer i en stigning i hormonet jasmoninsyre og transkriptionen af forsvars gener1. En af de mest kendte damps er systemIn, et polypeptid, der dannes ved kavalergang af de større prosystemin protein efter et blad er såret2,3. Den jasmoninsyre sårrespons er yderligere moduleret af herbivore-associerede molekylære mønstre (HAMPs), som kan udledes af Caterpillar spyt, tarmindhold (regurgitant) og afføring (Frass)4. Insekter bruger disse stoffer til enten at øge eller unddrage sig forsvaret svar5. Transkriptionsfaktorer derefter viderebringe budskabet fra hormon signaler i forsvaret svar via regulering af downstream Defense gener6,7,8.
Nogle plante-insekt interaktion undersøgelser, der anvendes i laboratorie-indstillinger er af simuleret type, med et mål om at tilnærme den naturlige metode til fodring af insektet. Simuleret æderne opnås normalt ved at skabe kunstige skader på plantevæv med forskellige værktøjer, der efterligner den specifikke mekanisme af insekt munddele tilstrækkelig til at forårsage frigivelse af damps og udløse produktionen af forsvars gener. Andre insekt-specifikke komponenter såsom orale sekreter eller regurgitant tilsættes ofte for at replikere bidraget fra hamps9,10,11. Skabelsen af en specifik størrelse og type af sår og anvendelsen af nøjagtige mængder af HAMPs er en fordel for disse typer af undersøgelser og kan tilbyde mere reproducerbare resultater. Naturlige æderne undersøgelser, hvor skader på plantevæv opnås ved anvendelse af felt-erhvervet eller laboratorium-opdrættet insekter, er ofte mere udfordrende, fordi sårstørrelse og hamp beløb styres af insekt adfærd og tilføje variation til Data. De naturlige versus simulerede metoder og deres fordele og ulemper er godt debatteret i litteraturen12,13,14.
For at studere tidlige signalerings hændelser, såsom transkriptionsfaktorer, skal en vis procentdel af bladet indtages i relativt kort tid, så larverne skal begynde at tygge straks og opretholde forbruget, indtil bladet er frosset til analyse. M. Sexta er en glubende feeder på flere natskygge-planter i mange af sine larvestadier, hvilket gør den ideel til at give maksimal skade på relativt kort tid15. Dette er praktisk, når man studerer tidlige signalerings hændelser, da anlæggets respons forekommer næsten umiddelbart efter et insekt kontakter blad overfladen16,17. Den almindeligt anvendte Clip Cage metode til indeslutning viser klodset, da flere bure ville kræve løbende justeringer i hele eksperimentet for at muliggøre fjernelse eller tilsætning af larver. Bladene skal også være store nok og stærke nok til at støtte flere insekter fodring på samme tid. Disse typer af kartoffelplanter kræver en stor mængde plads til at observere fodring. Larverne vil ofte flytte til undersiden af blad overfladen, hvilket også gør fodring observationer ganske vanskeligt. Det er helt klart besværligt at bruge hele planter til at udføre disse eksperimenter.
Den nuværende undersøgelse bruger fritliggende blade isoleret i Petri skåle snarere end hele planter til at strømline og forenkle hele planten tilgang til at studere herbivory. Anvendelsen af protokollen i denne undersøgelse er begrænset til observation af en gruppe af C2H2 transkriptionsfaktorer induceret tidligt i kartoffel blade efter planteædende skader af M. Sexta larvae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er unødvendigt at anvende eksisterende plantebeskyttelsesmetoder for hele planten for at nå målet med denne særlige undersøgelse (dvs. screene et sæt kandidat gener for deres reaktion på infestation). Den indlysende fordel ved den fritliggende blad raffinement er afkortning den tid, det tager at udføre æderne assays. Den tunge natur af hele planter med Clip bure elimineres og assays udføres hurtigere, da planter så unge som 2 uger kan bruges til at høste blade. Det kræver også en meget mindre fodaftryk …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Bob Farrar og Alexis Park for at levere insekter, der anvendes i denne undersøgelse, og for deres ekspertise i larve iscenesættelse. Yderligere tak til Michael Blackburn og Saikat Ghosh for kritisk gennemgang af manuskriptet.
Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med henblik på at give specifikke oplysninger og ikke indebærer anbefaling eller godkendelse af det amerikanske landbrugsministerium.
USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
Referências
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
