Detached पत्ता परख चबाने कीट Manduca sexta द्वारा संक्रमण के दौरान आलू में जीन अभिव्यक्ति अध्ययन को सरल बनाने के लिए
Summary
प्रस्तुत विधि आलू की पत्तियों को Manduca sexta लार्वा के आवेदन के माध्यम से प्राकृतिक शाकाहारी क्षतिग्रस्त संयंत्र ऊतक बनाता है. संयंत्र ऊतक कीट जड़ी बूटी के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रियाओं में शामिल छह प्रतिलेखन कारक homologs की अभिव्यक्ति के लिए परख गया है.
Abstract
कीट जड़ी बूटी के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के multitrophic प्रकृति जैविक प्रतिकृति की बड़ी संख्या की मांग, सरल, अधिक सुव्यवस्थित जड़ी बूटी प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत पैदा. चबाने वाले कीटों के क्षोभ का अध्ययन आमतौर पर संपूर्ण पादप प्रणालियों में किया जाता है। हालांकि इस पूरे जीव रणनीति लोकप्रिय है, यह आवश्यक नहीं है अगर इसी तरह की टिप्पणियों एक अलग पत्ती में दोहराया जा सकता है. धारणा यह है कि संकेत transduction के लिए आवश्यक बुनियादी तत्वों पत्ती के भीतर ही मौजूद हैं. संकेत transduction में जल्दी घटनाओं के मामले में, कोशिकाओं को केवल क्षोभ से संकेत प्राप्त करने और पड़ोसी कोशिकाओं जो जीन अभिव्यक्ति के लिए परख रहे हैं करने के लिए उस संकेत संचारित करने की जरूरत है.
प्रस्तावित विधि बस टुकड़ी के समय में परिवर्तन. पूरे पौधे के प्रयोगों में, लार्वा एक ही पत्ती तक ही सीमित होते हैं जो अंततः पौधे से अलग हो जाते हैं और जीन अभिव्यक्ति के लिए परख लगाते हैं। यदि उच्छेदन के क्रम को उलट दिया जाता है, पूरे संयंत्र अध्ययन में पिछले से, अलग अध्ययन में पहले करने के लिए, खिला प्रयोग सरल है.
सोलनम ट्यूबरोसम var. केनेबेक को एक सरल ऊतक संस्कृति माध्यम में नोडल हस्तांतरण द्वारा प्रचारित किया जाता है और यदि वांछित हो तो आगे के विकास के लिए मिट्टी में स्थानांतरित किया जाता है। पत्तियों को मूल संयंत्र से निकाला जाता है और पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित किया जाता है जहां भोजन परख एम सेक्स्टाके लार्वा चरणों के साथ आयोजित की जाती है . क्षतिग्रस्त पत्ती ऊतक संकेत transduction में अपेक्षाकृत जल्दी घटनाओं की अभिव्यक्ति के लिए परख है. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण संक्रमण-विशिष्ट Cys2-His2 (C2H2) प्रतिलेखन कारकों की पहचान की, जल्दी प्रतिक्रिया अध्ययन में अलग पत्तियों का उपयोग करने की सफलता की पुष्टि. विधि पूरे संयंत्र infestations की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है और कम जगह का उपयोग करता है.
Introduction
हर्बीवरी आणविक घटनाओं की एक श्रृंखला है जिसके दौरान एक संयंत्र दोनों हमले की पहचान कर सकते हैं और अपने अस्तित्व के लिए एक उचित प्रतिक्रिया माउंट गति में सेट. एक पौधे चबाने कीड़े से दो बुनियादी संकेत प्राप्त करता है; एक ऊतक को शारीरिक क्षति से और दूसरा कीट-विशिष्ट पदार्थों से। नुकसान से जुड़े आणविक पैटर्न (DAMPs) लार्वा mouthparts द्वारा बनाई गई क्षति के जवाब में जारी कर रहे हैं और एक अच्छी तरह से परिभाषित घाव प्रतिक्रिया है कि हार्मोन जैस्मोनिक एसिड में वृद्धि और रक्षा जीन के प्रतिलेखन में परिणाम ट्रिगर1. सबसे प्रसिद्ध DAMPs में से एक systemin, एक पॉलीपेप्टाइड है कि एक पत्ती के बाद बड़ा प्रोसिस्टमिन प्रोटीन के दरार से बनता है2,3घायल है. जैस्मोनिक एसिड घाव प्रतिक्रिया आगे शाकाहारी संबद्ध आणविक पैटर्न (HAMPs), जो कैटरपिलर लार, आंत सामग्री (पुनर्गुण) और मल (Fras)4से प्राप्त किया जा सकता द्वारा संग्राहक है। कीट इन पदार्थों का उपयोग रक्षा प्रतिक्रिया5को बढ़ावा देने या उससे बचने के लिए करते हैं . ट्रांसक्रिप्शन कारक तो डाउनस्ट्रीम रक्षा जीन6,7,8के विनियमन के माध्यम से रक्षा प्रतिक्रिया में हार्मोन संकेतों से संदेश रिले .
प्रयोगशाला सेटिंग्स में इस्तेमाल कुछ संयंत्र कीट बातचीत अध्ययन नकली प्रकार के हैं, कीट द्वारा खिलाने की प्राकृतिक विधि लगभग के लक्ष्य के साथ. नकली जड़ी बूटी आमतौर पर विभिन्न उपकरणों के साथ संयंत्र के ऊतकों को कृत्रिम क्षति बनाने के द्वारा पूरा किया जाता है जो DAMPs की रिहाई का कारण बनने और रक्षा जीनों के उत्पादन को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त कीट mouthparts के विशिष्ट तंत्र की नकल करते हैं। अन्य कीट-विशिष्ट घटक जैसे मुख स्राव या पुनरुत्पादक को प्रायः हैम्प्स9,10,11से अंशदान को दोहराने के लिए मिलाया जाता है . एक विशिष्ट आकार और घाव के प्रकार और HAMPs की सटीक मात्रा के आवेदन के निर्माण के अध्ययन के इन प्रकार के लिए एक लाभ है और अधिक reproduible परिणाम की पेशकश कर सकते हैं. प्राकृतिक जड़ी बूटी अध्ययन, जहां संयंत्र के ऊतकों को नुकसान क्षेत्र प्राप्त या प्रयोगशाला-आहार कीड़े के आवेदन द्वारा पूरा किया जाता है, अक्सर अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि घाव आकार और HAMP मात्रा कीट व्यवहार द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं और परिवर्तनशीलता जोड़ने के लिए डेटा. साहित्य12,13,14में प्राकृतिक बनाम नकली तरीकों और उनके फायदे और नुकसान पर अच्छी तरह से बहस हो रही है .
प्रतिलेखन कारकों जैसे प्रारंभिक संकेतन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, पत्ती का एक निश्चित प्रतिशत अपेक्षाकृत कम समय में सेवन किया जाना चाहिए, इसलिए लार्वा को तुरंत चबाना शुरू कर देना चाहिए और विश्लेषण के लिए जमे हुए होने तक खपत को बनाए रखना चाहिए। एम sexta अपने लार्वा चरणों में से कई के दौरान कई solanaceous पौधों पर एक voracious फीडर है, यहसमय 15की एक अपेक्षाकृत कम राशि में अधिकतम नुकसान प्रदान करने के लिए आदर्श बना रही है. प्रारंभिक संकेतन घटनाओं का अध्ययन करते समय यह सुविधाजनक होता है क्योंकि किसी कीट के संपर्क में आने के लगभग तुरंत बाद पौधे की प्रतिक्रिया होती है जो पत्ती की सतह16,17 . रोकथाम के आमतौर पर इस्तेमाल किया क्लिप पिंजरे विधि अनाड़ी साबित होता है, के रूप में कई पिंजरों को हटाने या लार्वा के अलावा के लिए अनुमति देने के लिए प्रयोग भर में निरंतर समायोजन की आवश्यकता होगी. पत्तियों को भी काफी बड़ा और मजबूत होना चाहिए जो एक ही समय में खिलाने वाले कई कीड़ों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है। आलू के पौधों के इन प्रकार के भोजन का निरीक्षण करने के लिए अंतरिक्ष की एक बड़ी राशि की आवश्यकता होती है। लार्वा अक्सर पत्ती की सतह के नीचे स्थानांतरित हो जाता है जो भोजन अवलोकन को काफी मुश्किल बना देता है। इन प्रयोगों को करने के लिए पूरे पौधों का उपयोग स्पष्ट रूप से बोझिल है.
वर्तमान अध्ययन को कारगर बनाने और जड़ी बूटी का अध्ययन करने के लिए पूरे संयंत्र दृष्टिकोण को सरल बनाने के लिए पूरे पौधों के बजाय पेट्री व्यंजनों में अलग अलग पत्तियों का उपयोग करता है। इस अध्ययन में प्रोटोकॉल का आवेदन एम सेक्स्टा लार्वा द्वारा शाकाहारी क्षति के बाद आलू की पत्तियों में जल्दी प्रेरित C2H2 प्रतिलेखन कारकों के एक समूह के अवलोकन तक सीमित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मौजूदा पूरे संयंत्र जड़ी बूटी के तरीके का उपयोग इस विशेष अध्ययन के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए अनावश्यक है (यानी, संक्रमण के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए उम्मीदवार जीन का एक सेट स्क्रीन). अलग पत्ती शोध?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन में इस्तेमाल कीड़े प्रदान करने के लिए और लार्वा मचान में अपनी विशेषज्ञता के लिए बॉब Farrar और एलेक्सिस पार्क धन्यवाद करना चाहते हैं. पांडुलिपि की समीक्षा के लिए माइकल ब्लैकबर्न और Saikat घोष के लिए अतिरिक्त धन्यवाद.
इस प्रकाशन में व्यापार नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए पूरी तरह से है और अमेरिकी कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन मतलब नहीं है.
USDA एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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