噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ
Summary
提示された方法は、ジャガイモの剥離葉にマンドゥカセクスタ幼虫の適用を通じて自然な手持ちの損傷植物組織を作成します。植物組織は、昆虫のハーブに対する早期応答に関与する6つの転写因子ホモロの発現のためにアッセイされる。
Abstract
昆虫のハーブボリーの遺伝子発現研究の多重栄養性は、生物学的複製の多数を必要とし、より簡単で、より合理化されたハーブプロトコルの必要性を作成する。噛む昆虫の摂動は、通常、植物システム全体で研究されています。この生物戦略全体が普及しているが、同様の観測値を単一の剥離した葉に複製できる場合は必要ない。信号伝達に必要な基本的な要素は、リーフ自体の中に存在することを前提とします。シグナル伝達の初期の事象の場合、細胞は摂動からシグナルを受け取り、そのシグナルを遺伝子発現のためにアッセイされる隣接細胞に送信するだけで済みます。
提案された方法は、単にデタッチメントのタイミングを変更します。植物全体の実験では、幼虫は、最終的に植物から切り離され、遺伝子発現のためにアッセイされる単一の葉に限定されます。切除の順序が逆化した場合、植物研究全体の最後から、剥離研究の第1位まで、摂食実験が簡素化される。
ソラナム管状var.ケネベックは、単純な組織培養培地における節点転写によって伝播し、必要に応じてさらなる成長のために土壌に移される。葉は親植物から取り除かれ、摂食アッセイがM.sextaの幼虫期で行われるペトリ皿に移される。損傷した葉組織は、信号伝達における比較的初期の事象の発現のためにアッセイされる。遺伝子発現解析では、侵入特異的Cys2-His2(C2H2)転写因子を同定し、早期応答研究で剥離葉を用いた成功を確認した。この方法は、植物全体の侵入よりも実行が容易であり、より少ないスペースを使用します。
Introduction
ハーブは、植物が攻撃を識別し、その生存のための適切な応答をマウントすることができる一連の分子イベントを動かしています。植物は、昆虫を噛むから2つの基本的な手がかりを受け取ります。1つは組織への物理的損傷から、もう1つは昆虫特有の物質から。損傷関連分子パターン(AMP)は、幼虫の口部によって生み出される損傷に応答して放出され、ホルモンジャスモン酸の増加および防御遺伝子1の転写をもたらす明確に定義された創傷応答を引き起こす。最もよく知られているダンプの1つは、システミン、葉が傷ついた後に大きなプロシマリンタンパク質の切断によって形成されるポリペプチド2、3である。ジャスモン酸創傷応答は、毛虫唾液、腸中身(逆流)およびFEC(フラス)4に由来することができる、ハーブ動物関連分子パターン(HAMP)によってさらに調節される。昆虫は、防御応答5を高めるか、または回避するためにこれらの物質を使用します。転写因子は、下流防衛遺伝子6、7、8の調節を介して防御応答におけるホルモン信号からのメッセージを中継する。
実験室の設定で使用される植物昆虫の相互作用研究の中には、昆虫による自然な摂食方法を近似する目的で、シミュレートされたタイプの植物と昆虫の相互作用研究があります。模擬ハーブは、通常、ダンプの放出を引き起こし、防御遺伝子の産生を引き起こすのに十分な昆虫の口分けの特定のメカニズムを模倣する様々なツールを使用して植物組織に人工的な損傷を作成することによって達成されます。口腔分泌物や逆流剤などの他の昆虫特異的成分は、多くの場合、HAMP9、10、11からの寄与を複製するために追加される。特定のサイズと創傷のタイプの作成と正確な量のHAMPの適用は、研究のこれらのタイプの1つの利点であり、より再現性の高い結果を提供することができます。植物組織への損傷が被養昆虫や実験室で飼育された昆虫の適用によって達成される自然なハーブ類研究は、創傷サイズとHAMP量が昆虫の行動によって支配され、変動性を追加するので、しばしばより困難である。データ。自然対シミュレートされた方法とその長所と短所は、文献12、13、14でよく議論されています。
転写因子などの早期シグナル伝達事象を研究するには、葉の一定の割合を比較的短い時間で消費する必要があるため、幼虫はすぐに噛み始め、葉が分析のために凍結されるまで消費を維持する必要があります。M.sextaは、その幼虫の段階の多くの間に複数のソラナス植物の貪欲なフィーダーであり、比較的短い時間15で最大ダメージを与えるのに理想的です。これは、昆虫が葉面16、17に接触した直後に植物応答が起こるので、早期シグナル伝達事象を研究する際に便利である。封じ込めの一般的に使用されるクリップケージの方法は、複数のケージが幼虫の除去または追加を可能にするために実験全体を通して継続的な調整を必要とするように、不器用であることを証明します。葉はまた、同時に複数の昆虫の餌を支えるのに十分な大きさと強さでなければなりません。これらのタイプのジャガイモ植物は、摂食を観察するために大量のスペースを必要とします。幼虫はしばしば葉の表面の下側に移動し、また摂食観察を非常に困難にします。これらの実験を行うために植物全体を使用することは明らかに面倒です。
現在の研究では、植物全体ではなくペトリ皿に分離された剥離葉を使用して、ハーブを研究するための植物全体のアプローチを合理化し、簡素化しています。本研究におけるプロトコルの適用は、M.セクスタ幼虫による生体損傷後のジャガイモ葉の早期誘導C2H2転写因子の群の観察に限定される。
Protocol
Representative Results
Discussion
既存の植物全植物のハーブの方法論の使用は、この特定の研究の目標を達成するために必要としない(すなわち、侵入に対する応答のための候補遺伝子のセットをスクリーニングする)。剥離した葉の精製の明らかな利点は、ハーブアッセイを行うのにかかる時間を短縮することである。クリップケージを持つ植物全体の扱いにくい性質は排除され、2週間の若い植物は葉を収穫するために使用?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究で使用される昆虫を提供し、幼虫のステージングに関する専門知識を提供してくれたボブ・ファラーとアレクシス・パークに感謝したいと思います。原稿の批判的なレビューのためのマイケル・ブラックバーンとサイカト・ゴーシュに感謝します。
本書における商号または商用製品の言及は、特定の情報を提供する目的でのみ行われ、米国農務省の勧告または推奨を意味するものではありません。
USDAは機会均等プロバイダーであり、雇用主です。
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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