Frittliggende Leaf analyser for å forenkle Gene Expression studier i potet under infestation av tygge insekt Manduca Sexta
Summary
Den presenterte metoden skaper naturlig herbivore skadet plante vev gjennom anvendelse av Manduca Sexta larver til frittliggende blader av potet. Anlegget vev er analyseres for uttrykk for seks transkripsjon faktor homologs involvert i tidlig svar på insekt herbivory.
Abstract
Multitrophic natur genuttrykk studier av insekt herbivory krever et stort antall biologiske replikeres, noe som skaper behovet for enklere, mer strømlinjeformet herbivory protokoller. Forstyrrelser av tygge insekter er vanligvis studert i hele anlegget systemer. Selv om hele denne organismen strategien er populær, er det ikke nødvendig hvis lignende observasjoner kan replikeres i et enkelt frittliggende blad. Forutsetningen er at grunnleggende elementer som kreves for signal Transduction er til stede i bladet selv. I tilfelle av tidlige hendelser i signal Transduction, celler trenger bare å motta signalet fra forstyrrelsene og overføre det signalet til nærliggende celler som er analyseres for genuttrykk.
Den foreslåtte metoden endrer bare tidspunktet for avløsning. I hele plante eksperimenter, larver er begrenset til et enkelt blad som er til slutt løsrevet fra anlegget og analyseres for genuttrykk. Hvis rekkefølgen av forbrukeravgift er reversert, fra siste i hele plante studier, til først i frittliggende studien, er fôring eksperimentet forenklet.
Solanum tuberosum var. Kennebec spres ved Nodal overføring i et enkelt vev kultur medium og overføres til jord for videre vekst hvis ønskelig. Bladene er excised fra den overordnede planten og flyttet til Petri retter der fôring analysen er gjennomført med larvestadiet stadier av M. Sexta. Skadet blad vev er analyseres for uttrykk for relativt tidlige hendelser i signal Transduction. Gene Expression analyse identifisert infestation-spesifikke Cys2-His2 (C2H2) transkripsjon faktorer, bekrefter suksessen med å bruke frittliggende blader i tidlig respons studier. Metoden er enklere å utføre enn hele anlegget infestations og bruker mindre plass.
Introduction
Herbivory setter i gang en rekke molekylære hendelser der en plante kan både identifisere angrep og montere en passende respons for sin overlevelse. En plante får to grunnleggende signaler fra tygge insekter; en fra den fysiske skaden på vevet og den andre fra insekt-spesifikke stoffer. Skade-Associated molekylære mønstre (demper) er utgitt som svar på skader opprettet av larvestadiet elektiske og utløse en veldefinert såret respons som resulterer i en økning i hormonet jasmonic syre og transkripsjon av Forsvaret gener1. En av de mest kjente demper er anlegg, en polypeptid som er dannet av kløften av større prosystemin protein etter et blad er såret2,3. Den jasmonic syre såret responsen er ytterligere modulert av herbivore-assosiert molekylær mønstre (HAMPs), som kan utledes fra Caterpillar spytt, gut innhold (regurgitant) og avføring (frass)4. Insekter bruker disse stoffene til enten å øke eller unngå forsvars responsen5. Transkripsjon faktorer deretter relé meldingen fra hormon signaler i forsvaret responsen via regulering av nedstrøms forsvaret gener6,7,8.
Noen plante-insekt interaksjon studier brukes i laboratoriet innstillingene er av simulert type, med et mål om tilnærme den naturlige metoden for fôring av insekt. Simulert herbivory oppnås vanligvis ved å skape kunstige skader å plante vev med ulike verktøy som etterligner den spesifikke mekanismen for insekt elektiske tilstrekkelig til å forårsake frigjøring av demper og utløse produksjon av forsvars gener. Andre insekt-spesifikke komponenter som oral sekreter eller regurgitant er ofte lagt for å gjenskape bidraget fra HAMPs9,10,11. Opprettelsen av en bestemt størrelse og type sår og anvendelse av presise mengder HAMPs er en fordel for disse typer studier og kan tilby mer reproduserbar resultater. Naturlig herbivory studier, der skade på plante vev oppnås ved anvendelse av felt-ervervet eller laboratorie-reist insekter, er ofte mer utfordrende fordi sår-størrelse og HAMP mengder styres av insekt atferd og legge variasjon til Data. Den naturlige versus simulerte metoder og deres fordeler og ulemper er godt diskutert i litteraturen12,13,14.
Å studere tidlig signalnettverk hendelser som transkripsjon faktorer, en viss prosent av bladet må forbrukes i en relativt kort tid, så larver må begynne å tygge umiddelbart og opprettholde forbruket til bladet er frosset for analyse. M. Sexta er en grådig mater på flere Solanaceous planter i løpet av mange av sine larvestadiet stadier, noe som gjør det ideelt for å formidle maksimal skade på relativt kort tid15. Dette er praktisk når du studerer tidlig signalering hendelser, som anlegget responsen skjer nesten umiddelbart etter at et insekt kontakter Leaf overflaten16,17. Den brukte klippet buret metode for forvaring beviser klønete, som flere bur ville kreve stadige justeringer gjennom hele eksperimentet for å tillate fjerning eller tilsetning av larver. Bladene må også være store nok og sterk nok til å støtte flere insekter fôring på samme tid. Disse typer potet planter krever en stor mengde plass til å observere fôring. Larver vil ofte flytte til undersiden av bladet overflaten som også gjør fôring observasjoner ganske vanskelig. Bruke hele planter til å utføre disse eksperimentene er klart tungvint.
Den nåværende studien bruker frittliggende blader isolert i Petri retter i stedet for hele planter for å effektivisere og forenkle hele anlegget tilnærming til å studere herbivory. Anvendelsen av protokollen i denne studien er begrenset til observasjon av en gruppe C2H2 transkripsjon faktorer indusert tidlig i potet blader etter planteetende skade av M. Sexta larver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruk av eksisterende hel plante herbivory metoder er unødvendig å oppnå målet med denne spesielle studien (dvs. skjermen et sett av kandidat gener for deres reaksjon på infestation). Den åpenbare fordel for frittliggende blad raffinement er forkorte tiden det tar å utføre herbivory analyser. Den uhåndterlig natur hele planter med klips bur er eliminert og analysene utføres før, siden planter så unge som 2 uker kan brukes til å høste blader. Det krever også en mye mindre fotavtrykk under fôring og mindre v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Bob Farrar og Alexis Park for å gi insekter som brukes i denne studien og for deres ekspertise i larvestadiet regi. Ytterligere takk til Michael Blackburn og SAIKAT Ghosh for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
Omtale av handelsnavn eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende for det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling eller støtte fra det amerikanske Landbruksdepartementet.
USDA er en lik mulighet leverandør og arbeidsgiver.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
Referências
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
