Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging di Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), e Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Summary
Qui, i protocolli per l’esecuzione di immagini di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) microfocus di tre animali invertebrati marini sono spiegati in dettaglio. Questo studio descrive passaggi quali la fissazione dei campioni, la colorazione, il montaggio, la scansione, la ricostruzione delle immagini e l’analisi dei dati. Vengono inoltre forniti suggerimenti su come il protocollo può essere regolato per diversi campioni.
Abstract
Tradizionalmente, i biologi hanno dovuto fare affidamento su metodi distruttivi come il sezionamento per studiare le strutture interne degli organismi opachi. L’imaging di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) non distruttivo è diventato un protocollo potente ed emergente in biologia, grazie ai progressi tecnologici nei metodi di colorazione dei campioni e nelle innovazioni nell’hardware microCT, nei computer di elaborazione e nei dati software di analisi. Tuttavia, questo protocollo non è comunemente usato, come è nei campi medico e industriale. Uno dei motivi di questo uso limitato è la mancanza di un manuale semplice e comprensibile che copra tutti i passaggi necessari: raccolta dei campioni, fissazione, colorazione, montaggio, scansione e analisi dei dati. Un’altra ragione è la grande diversità dei metazoi, in particolare degli invertebrati marini. A causa delle diverse dimensioni, morfologie e fisiologie degli invertebrati marini, è fondamentale regolare le condizioni sperimentali e le configurazioni hardware ad ogni fase, a seconda del campione. Qui, i metodi di imaging microCT sono spiegati in dettaglio utilizzando tre invertebrati marini filogeneticamente diversi: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) e Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Vengono inoltre forniti suggerimenti sull’esecuzione di immagini microCT su vari animali.
Introduction
I ricercatori biologici hanno generalmente dovuto fare sezioni sottili ed eseguire osservazioni con microscopia leggera o elettronica al fine di studiare le strutture interne degli organismi opachi. Tuttavia, questi metodi sono distruttivi e problematici se applicati a esemplari rari o preziosi. Inoltre, diversi passaggi del metodo, ad esempio l’incorporamento e il sezionamento, richiedono molto tempo e possono essere necessari diversi giorni per osservare un campione, a seconda del protocollo. Inoltre, quando si maneggiano numerose sezioni, c’è sempre la possibilità di danneggiare o perdere alcune sezioni. Tecniche di sgombero dei tessuti sono disponibili per alcuni esemplari1,2,3,4,5 ma non sono ancora applicabili a molte specie animali.
Per superare questi problemi, alcuni biologi hanno iniziato a utilizzare la tomografia computerizzata a raggi X microfocus (microCT)6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Nella TC a raggi X, il campione viene irradiato con raggi X da varie angolazioni generate da una sorgente di raggi X che si muove intorno al campione e i raggi X trasmessi vengono monitorati da un rilevatore che si muove anche intorno al campione. I dati di trasmissione a raggi X ottenuti vengono analizzati per ricostruire le immagini trasversali del campione. Questo metodo consente l’osservazione di strutture interne senza distruzione del campione. A causa della sua sicurezza e facilità, è comunemente usato in applicazioni mediche e dentali, e sistemi CT possono essere trovati in ospedali e centri dentali in tutto il mondo. Inoltre, la TAC industriale a raggi X viene spesso utilizzata per l’osservazione di campioni non medici per l’ispezione e la metrologia nel campo industriale. A differenza della Tac medica, in cui la sorgente di raggi X e i rilevatori sono mobili, le due parti sono fissate nella TC industriale, con il campione che ruota durante la scansione. La TC industriale produce generalmente immagini ad alta risoluzione rispetto alla TC medica ed è indicata come microCT (risoluzione a livello di micrometro) o nanoCT (risoluzione a livello di nanometri). Recentemente, la ricerca con microCT è rapidamente aumentata in vari campi della biologia14,15,16,17,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa’ di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34.
Studi biologici che utilizzano TC inizialmente miravano a strutture interne che consistono principalmente di tessuto duro, come l’osso. I progressi nelle tecniche di colorazione utilizzando vari agenti chimici hanno permesso la visualizzazione dei tessuti molli in vari organismi6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa’ di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34. Di questi reagenti, gli agenti di contrasto a base di iodio sono relativamente sicuri, economici e possono essere utilizzati per la visualizzazione dei tessuti molli in vari organismi7,14. Per quanto riguarda gli invertebrati marini, la microCT è stata ampiamente utilizzata su animali come molluschi6,25,32,33, annelidi18,19, 20 anni , 28e arboridi21,23,29,31. Tuttavia, ci sono state poche segnalazioni su altri phyla animale, come bryozoans6, xenacoelomorfi26, e cnidarians24,30. In generale, ci sono stati meno studi che utilizzano microCT sugli invertebrati marini rispetto a quelli sui vertebrati. Uno dei motivi principali di questo uso limitato sugli invertebrati marini è la grande diversità osservata in questi animali. A causa delle loro diverse dimensioni, morfologie e fisiologie, ogni specie reagisce in modo diverso alle diverse procedure sperimentali. Pertanto, durante la preparazione del campione è fondamentale scegliere la fissazione e il reagente di colorazione più appropriati e impostare le condizioni ad ogni fase, regolate per ogni specie. Allo stesso modo, è anche necessario impostare le configurazioni di scansione, come il metodo di montaggio, la tensione, la corrente, la velocità di ingrandimento meccanica e la potenza di risoluzione dello spazio, in modo appropriato per ogni campione. Per superare questo problema, è essenziale un manuale semplice e comprensibile che copra tutti i passaggi necessari, spiega come ogni passaggio può essere regolato a seconda del campione e mostra esempi dettagliati tratti da più campioni.
Nel presente studio, descriviamo il protocollo di microCT, passo dopo passo, dalla fissazione dei campioni all’analisi dei dati, utilizzando tre specie di invertebrati marini. Gli esemplari dell’anemone marino Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) sono stati raccolti nei pressi della Stazione Biologica Marina di Misaki, dell’Università di Tokyo. Avevano un corpo sferico e morbido di circa 2 cm di diametro (Figura 1A-C). Sono stati raccolti anche campioni di Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) nei pressi della stazione biologica marina di Misaki. Erano vermi sottili che erano di circa 1,5 cm di lunghezza, con chaetae duri presenti lungo tutto il corpo (Figura 1D). Un xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) esemplare è stato raccolto vicino a Shimoda Marine Research Center, Università di Tsukuba, durante il 13th COASTAL Organism Joint Survey. Era un verme dal corpo morbido che era di circa 0,8 cm di lunghezza (Figura 1E). Le regolazioni effettuate per le condizioni e le configurazioni di ciascun campione sono spiegate in dettaglio. Il nostro studio fornisce diversi suggerimenti su come eseguire l’imaging microCT sugli invertebrati marini, e speriamo che ispirerà i biologi a utilizzare questo protocollo per la loro ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fissativi che utilizzano formalina, come la soluzione formalina 10% (v/v) in acqua di mare utilizzata in questo studio, sono noti per preservare la morfologia di diversi invertebrati marini e sono spesso utilizzati per l’imaging microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Tuttavia, restrizioni sull’uso d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Toshihiko Shiroishi per la sua assistenza e per aver fornito l’ambiente di ricerca durante questo studio. Siamo grati a Kensuke Yanagi e Takato Izumi per consigli su A. equina, e Masaatsu Tanaka per consigli sul esemplare Harmothoe sp. Vorremmo ringraziare il personale del Shimoda Marine Research Center, dell’Università di Tsukuba, e della Misaki Marine Biological Station, l’Università di Tokyo per il loro aiuto nelle collezioni di campioni. Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l’editing in lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato dal JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP2671022) all’HN, e dalla JAMBIO, Associazione Giapponese per la Biologia Marina.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
Referências
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