Her præsenterer vi en protokol for at udtrykke, solubilize og rense flere eukaryote Borat transportvirksomheder med homologi til familien SLC4 transporter ved hjælp af gær. Vi beskriver også en kemisk tværbindingsmidler analyse for at vurdere renset homomeric proteinerne for multimeriske forsamling. Disse protokoller kan tilpasses andre udfordrende Membranproteiner.
Familien opløst stof Carrier 4 (SLC4) af proteiner kaldes bikarbonat transportvirksomheder og omfatter den arketypiske protein Anion varmeveksler 1 (AE1, også kendt som Band 3), den mest rigelige membran protein i de røde blodlegemer. Familien SLC4 er homolog med Borat transportvirksomheder, som er blevet karakteriseret i planter og svampe. Det er fortsat en betydelig teknisk udfordring at udtrykke og rense membrantransport proteiner til homogenitet i mængder, der er egnet til strukturelle eller funktionelle studier. Her beskriver vi detaljerede procedurer for overekspression af Borat transportvirksomheder i Saccharomyces cerevisiae, isolation af gær membraner, oploesning af protein af vaskemiddel og rensning af Borat transporter homologs fra S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaog Oryza sativa. Vi detalje også en glutaraldehyd cross-linking eksperiment for at analyse multimerization af homomeric transportører. Vores generelle procedurer kan anvendes på alle tre proteiner og er blevet optimeret til effektivitet. Mange af de strategier, der er udviklet her kan udnyttes til undersøgelse af andre udfordrende Membranproteiner.
Vanskeligt ved at fremskaffe tilstrækkelige mængder af renset membran proteiner forbliver en kritiske flaskehals i forfølgelsen af strukturelle og funktionelle studier af receptorer, ionkanaler og transportvirksomheder. Mange protokoller findes for moderat høj overførselshastighed rørledninger til skærmen og find kandidat Membranproteiner der express godt nok til at aktivere efterfølgende in vitro- undersøgelser1,2,3,4 . Typisk, proteiner er markeret med et N – eller C-terminale grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), og udtrykket niveauer overvåges-gel fluorescens eller ved registrering af fluorescens størrelse udstødelse kromatografi (FSEC)5. Sådanne tilgange aktiverer triaging membran protein kandidater i høj udtrykker proteiner, moderat eller lav udtrykte proteiner, eller proteiner, der udtrykker dårligt eller slet ikke. Denne fremgangsmåde fungerer godt, når den eksperimentelle design er at undersøge store mængder af kandidat gener med henblik på at vælge, hvilken protein udtrykker bedst. Dog i nogle tilfælde, er en eksperimenterende tilgang baseret på at studere en bestemt membran protein, som kan være udfordrende, når denne Proteinniveau udtryk i rækken moderat eller lav. Desuden, kan nogle gange i disse tilfælde udtryk kun minimalt hæves ved at ændre konstruktion via udeladelser, thermostabilizing mutationer eller codon optimering. Det er derfor undertiden nødvendigt at optimere membran protein proteinekspression og -oprensning protokoller for Membranproteiner, der udtrykker kun moderat godt.
SLC4 familie af transportvirksomheder omfatter bikarbonat transporter Anion varmeveksler 1 (også kendt som Band 3), den mest rigelige membran protein i røde blodlegemer6og en vigtig drivkraft for cellulær respiration. Familien SLC4 er homolog med Borat transportvirksomheder, som er kritiske i planter og har vist sig at udstille en lignende struktur Anion veksleren 1 såvel som natrium-kombineret SLC4 transportører7,8,9 ,10. Her rapporterer vi optimeret protein proteinekspression og -oprensning protokoller ved hjælp af S. cerevisiae at rense tre forskellige Borat transportvirksomheder fundet i gær og planter. Vi fremhæve i detaljer vigtigste skridt vi tog til at optimere udbytte og effektivitet af purifications til ensartethed. Desuden rapporterer vi en kemiske tværbindingsmidler analyse ved hjælp af glutaraldehyd for at overvåge multimeriske samling af disse transportører i konteksten af en renset protein-vaskemiddel-lipid komplekse. Den tværbindingsmidler eksperiment kan hjælpe vurdere homolog og vaskemiddel egnet ved at vurdere tilstanden multimeriske af oligomere transportvirksomheder efter rensning.
Denne protokol antager, at den ønskede transporter er blevet klonet i en 2 µ afledt plasmid under for GAL1 til udtryk i S. cerevisiaeinducerbar kontrol. For disse procedurer, DNA blev brugt kodning fuld længde vildtype Borat transportvirksomheder Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12og Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . C-terminus i hver konstruktion er vedlagt med en 10-hans-tag og en thrombin kavalergang site indsættes mellem transportvirksomheden og 10-hans-tag til at aktivere sin afsked hvis ønsket. Protokollen vil også antage, at plasmidet allerede er blevet omdannet til den DSY-5 udtryk belastning af S. cerevisiae komplet supplerende selektive medier (CSM) mangler histidin.
Her har vi delt detaljerede protokoller, der resulterer i renseanlæg til homogenitet af tre særskilte eukaryote Borat transportvirksomheder. Protokollerne præsenteres her er afledt af andre protokoller for udtryk for integreret Membranproteiner i S. cerevisiae1,14, og vores optimeringer resultat i både forbedret renhed og forbedrede udbytter. Parametrene optimeret her omfatter celle kultur vækst diskenheder og gange, perle-slå lysis procedurer, buffer sammensætning under celle lysis og protein oprensning, mængden af vaskemiddel anvendes pr. gram membran, metal ion identificere i affinitet renseanlæg, volumen af kolonnen affinitet og gennemførelsen af en tværbindingsmidler analyse til at vurdere homolog og vaskemiddel egnet ved at vurdere tilstanden multimeriske af oligomere transportvirksomheder. Protokollerne er vellykket for flere SLC4 homologs fra planter og svampe arter. En begrænsning af alle strategier til rensning af integreret Membranproteiner findes ingen universel membran protein oprensning metode, der er garanteret til at arbejde. Det er muligt, at vores protokoller er mere tilbøjelige til at blive en succes for proteiner tættere i sekvens identitet og struktur til SLC4 transportvirksomheder, og dermed medlemmer af SLC4, SLC23 og SLC26 familierne kunne være lovende mål15. Ligeledes, den mere evolutionært fjernt fra Borat transportvirksomheder en membran transporter kan være, jo mere sandsynligt protokollen skal være anderledes, såsom ved at variere ekspressionssystem, vaskemiddel eller andre vigtige parametre4.
Protokollen tager fordel af de mest almindeligt anvendte affinitet tag i protein oprensning, hans-tag. På trods af tilstedeværelsen af urenheder i de indledende eluted brøker, kombinationer af nikkel affinitet, omfattende vask og efterfølgende sek rensning resulterer i den højt oprenset protein. En 10-hans-tag giver mulighed for strengere imidazol vasker og således kan fjerne flere baggrund bindende proteiner end kan fjernes i vasker tilladt af 8-hans – eller 6-hans-tags. Vores valg for ren fraktioner fejle på den konservative side af de de fleste meget ren gel fraktioner, som svarer til peak sek fraktioner. Endelige protein udbyttet kan øges ved at samle og koncentrere flere fraktioner, omend med trade-off af lidt mindre ren protein. De metoder, der præsenteres her aktiveret rensning af AtBor1 i mængder, der førte til bestemmelse af sin krystal struktur7, med rensning forskelle består af afskære hans-tag og udveksle transportvirksomheden i en anden vaskemiddel for at forbedre krystal diffraktion7.
Vores protokol rejser vigtige overvejelser for valg af homologs og vaskemiddel bruges til solubilize og rense dem. Bettinas er et fælles første valg for vaskemiddel, fordi det er relativt mild, ofte succes på solubilizing, og har været anvendt i strukturelle og funktionelle studier af en lang række Membranproteiner. Ved afgørelsen af, om vaske-og rengøringsmidler er et dårligt valg for en membran, er en fælles metode for vurdering om protein giver et enkelt monodisperse højdepunkt på et sekund kromatogram, snarere end et stort højdepunkt i dødvolumen eller et interval af polydisperse toppe, som angive fejlfoldede eller ustabil protein. En mere subtil overvejelse er rejst af vores rensning af ScBor1. Det renser i store mængder og ser gunstige og monodisperse på et sekund kromatogram, hvilket tyder på, det kunne være et attraktivt mål for strukturelle undersøgelser. Vores tværbindingsmidler analyse viser imidlertid, at det er en monomer når renset. Mens det er muligt at ScBor1 indbygget kunne eksistere som en monomer i cellen, tyder undersøgelser på, at SLC4 transportører og deres homologs er tilbøjelige til at være dimerer7,8,9,10. Vores udvikling af den tværbindingsmidler analyse opstod efter crystallizing og løse strukturen af AtBor1. Dog havde vi været mulighed for at vurdere ScBor1 i forhold til AtBor1 med den tværbindingsmidler analyse, værdifuld tid og forskning indsats kunne er blevet omdirigeret til udøvelse af AtBor1 i stedet for ScBor1, hvor sidstnævnte i sidste ende ikke lykkedes i krystallisering og diffraktion eksperimenter. Denne analyse kan således hjælpe forskerne med at skelne mellem enten homologs eller rengøringsmidler til brug når forfølger strukturelle undersøgelser for at prioritere betingelser, hvor proteinet bevarer sin mistanke om indfødte kropsbygning. Analysen kan desuden være bruges at sonde hvor aminosyrer er afgørende for multimerization, for at finde aminosyre udskiftninger, at destabilisere multimerization grænseflade og føre til forpligter monomerer. En sådan fremgangsmåde har været anvendt til sonde funktionelle betydningen af homomeric forsamling i membranen transportvirksomheder16,17,18.
En generel fordel ved vores metode er, at gær har vist sig at give udtryk for mange udfordrende Membranproteiner af forskellige funktion1. Derudover fremme dens lave omkostninger og vækst gange dens tilgængelighed for mange forskningsindsats, der kan være mindre i stand til at bruge udtryk strategier, der kræver vævskultur eller dyre vækst medier. De procedurer, der præsenteres her er forholdsvis billig og kan udføres i én uge, hvilket understreger mulighederne for metoden. Gennemførelsen af disse protokoller kan hjælpe aktiverer strukturelle og funktionelle studier af andre udfordrende Membranproteiner.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af startup midler på Davidson College.
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Imidazole | Acros | 12202 | |
Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |