Hier presenteren we een protocol om express, solubilize en zuiveren van diverse eukaryotic boraat vervoerders met homologie aan de SLC4 transporter familie met behulp van gist. Ook beschrijven we een chemische cross-linking test om te beoordelen van de gezuiverde homomeric eiwitten voor montage van de multimeric. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende membraaneiwitten.
De opgeloste stof Carrier 4 (SLC4)-familie van eiwitten heet de bicarbonaat vervoerders en omvat het archetypische eiwit Anion Exchanger 1 (AE1, ook bekend als Band 3), de meest voorkomende membraan eiwit in de rode bloedcellen. De familie SLC4 is homoloog met boraat vervoerders, die in planten en schimmels gekenmerkt. Het blijft een grote technische uitdaging te uiten en te zuiveren van vervoer membraaneiwitten aan homogeniteit in hoeveelheden geschikt voor structurele of functionele studies. Hier beschrijven we gedetailleerde procedures voor de overexpressie van boraat vervoerders in Saccharomyces cerevisiae, isolatie van gist membranen, solubilisatie van eiwitten door wasmiddel en zuivering van boraat vervoerder homologen van S. cerevisiae, Arabidopsis thalianapt Oryza sativa. Wij ook detail een experiment om te multimerization van homomeric vervoerders assay dwarsbinding Glutaaraldehyde. Onze algemene procedures kunnen worden toegepast op alle drie eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor werkzaamheid. Veel van de strategieën die hier ontwikkeld kunnen worden gebruikt voor de studie van andere uitdagende membraaneiwitten.
De moeilijkheid in het verkrijgen van voldoende hoeveelheden van gezuiverde membraan eiwit blijft een kritische knelpunt bij het nastreven van structurele en functionele studies van receptoren, ionenkanalen en vervoerders. Er zijn veel protocollen voor matig hoge doorvoer pijpleidingen naar scherm en vind kandidaat membraaneiwitten die uitdrukking geven aan goed genoeg om latere in vitro studies1,2,3,4 . Meestal eiwitten zijn gelabeld met een N – of C-terminaal groen fluorescente proteïne (GFP) en expressie niveaus worden gecontroleerd, hetzij door fluorescentie-gel, hetzij door fluorescentie-detectie grootte uitsluiting chromatografie (FSEC)5. Een dergelijke aanpak in staat stellen de triaging van membraan eiwit kandidaten in hoge waarin eiwitten, matige of laag uitspreken van eiwitten, of eiwitten die uitdrukking geven aan slecht of helemaal niet. Deze aanpak werkt goed wanneer de proefopzet is te groot aantal kandidaat-genen met de bedoeling te selecteren welk eiwit spreekt het beste onderzoeken. Echter in sommige gevallen, is een experimentele aanpak gebaseerd op het bestuderen van een bepaalde membraan eiwit, dat kan lastig zijn wanneer de expressie van dat eiwitniveaus in de gematigde of lage bereik. Daarnaast, kunnen soms in deze gevallen expressie niveaus slechts minimaal verhoogd worden door een wijziging van de constructie via opschoningen, thermostabilizing mutaties of codon optimalisatie. Het is daarom, soms noodzakelijk voor het optimaliseren van membraan eiwit expressie en zuivering protocollen voor membraaneiwitten die slechts matig goed uitdrukken.
De SLC4 familie van vervoerders omvat de bicarbonaat vervoerder Anion Exchanger 1 (ook bekend als Band 3), de meest voorkomende membraan eiwit in rode bloedcellen6en een belangrijke stimulans van cellulaire ademhaling. De familie SLC4 is homoloog met boraat vervoerders, die zijn essentieel in planten en is aangetoond dat ze vertonen een vergelijkbare structuur aan Anion Exchanger 1 alsmede aan natrium-coupled SLC4 vervoerders7,8,9 ,10. Wij rapporteren hier geoptimaliseerde expressie en zuivering EiwitProtocollen S. cerevisiae met drie verschillende boraat vervoerders gevonden in gist en planten zuiveren. We benadrukken in detail belangrijke stappen we hebben naar het optimaliseren van het rendement en de efficiëntie van de zuivering aan homogeniteit. Daarnaast rapporteren we een chemische cross-linking assay Glutaaraldehyde gebruiken om te controleren de multimeric vergadering van deze vervoerders in het kader van een gezuiverde eiwit-wasmiddel-lipide-complex. De cross-linking experiment kan helpen homolog en afwasmiddel geschiktheid evalueren door beoordeling van de toestand van de multimeric van oligomere vervoerders na zuivering.
Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de gewenste vervoerder in een plasmide 2 µ afgeleid onder afleidbare controle van de promotor van de GAL1 voor expressie in S. cerevisiaeheeft gekloond. Voor deze procedures, DNA werd gebruikt codering full-length wild-type boraat vervoerders Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12, en Oryza sativa -Bor3 (OsBor3)13 . De C-terminus in elk construct is toegevoegd met een 10-zijne-tag en een trombine breukzijde ingevoegd tussen de vervoerder en de 10-zijne-tag om haar verwijderen, als gewenst. Het protocol zal ook aannemen dat het plasmide al omgetoverd tot de DSY-5 expressie stam van S. cerevisiae op volledige aanvullende selectieve media (CSM) ontbreken van histidine.
We hebben hier gedetailleerde protocollen die in de zuivering aan homogeniteit van drie verschillende eukaryotische boraat vervoerders resulteren gedeeld. De protocollen die hier gepresenteerd worden afgeleid uit andere protocollen voor de expressie van integraal membraaneiwitten in S. cerevisiae1,14, en het resultaat van onze optimalisaties in zowel de verbeterde zuiverheid en de verbeterde opbrengsten. De parameters geoptimaliseerd hier omvatten cel cultuur groei volumes en tijden, kraal-kloppend lysis van de procedures, buffer samenstelling tijdens lysis van de cel en eiwitreiniging, hoeveelheid wasmiddel gebruikt per gram membraan, metaalion identificeren in affiniteit zuivering, volume van de kolom affiniteit en de uitvoering van een cross-linking assay evalueren homolog en afwasmiddel geschiktheid met de beoordeling van de toestand van de multimeric van oligomere vervoerders. De protocollen zijn succesvol voor meerdere SLC4 homologen van de plant en schimmel soorten. Een beperking van alle strategieën voor de zuivering van integraal membraaneiwitten is dat er geen universele membraan eiwit zuivering methode dat is gegarandeerd om te werken. Het is mogelijk dat onze protocollen waarschijnlijker om succesvol te zijn zijn voor eiwitten dichter in de identiteit van de volgorde en structuur SLC4 vervoerders, en daarmee de gezinsleden, SLC4, SLC23 en SLC26 veelbelovende worden kon richt zich op15. Ook de meer evolutionair ver van de vervoerders boraat zou een membraan transportwagen, hoe groter de kans het protocol zal hebben om anders te zijn, zoals door het variëren van de expressie systemen, wasmiddel of andere essentiële parameters-4.
Het protocol maakt gebruik van de meest gebruikte affiniteit tag in EiwitReiniging, de zijne-tag. Ondanks de aanwezigheid van verontreinigingen in de eerste eluted breuken, de combinaties van nikkel affiniteit, uitgebreide wassen en latere SEC zuivering resulteert in de hoogst gezuiverde proteïne. Een 10-zijne-tag maakt het mogelijk voor de strengere imidazool wast en dus meer achtergrond bindende proteïnen dan kan worden verwijderd in wast toegestaan door 8-Hsi – of 6-zijne-tags kunt verwijderen. Onze selecties voor zuivere breuken err op de conservatieve zijde van de meeste fracties van zeer zuivere gel, die correspondeert met de fracties van de SEC piek. Definitieve eiwit opbrengst kunnen worden verhoogd door te bundelen en te concentreren meer breuken, zij het met de inruil van iets minder zuivere eiwitten. De hier gepresenteerde methoden ingeschakeld de zuivering van AtBor1 in hoeveelheden die hebben geleid tot de vaststelling van haar kristal structuur7, met zuivering verschillen uit het afsnijden van de His-tag en het uitwisselen van de vervoerder in een andere wasmiddel te verbeteren kristal diffractie7.
Ons protocol werpt belangrijke overwegingen voor de selectie van homologen en het wasmiddel gebruikt om te solubilize en te zuiveren van hen. DDM is een gemeenschappelijk eerste keuze voor wasmiddel, omdat het relatief mild, vaak succesvol in het solubilizing, en is gebruikt in structurele en functionele studies van een breed scala aan membraaneiwitten. Om te bepalen of een wasmiddel een slechte keuze voor een membraan is, wordt een gemeenschappelijke methode voor de evaluatie of het eiwit geeft een enkele monodispers piek op het chromatogram van een SEC, in plaats van een grote piek in het dode volume of een bereik van polydisperse pieken, die het geven van misfolded of instabiel eiwit. Een meer subtiele aandacht is opgevoed door onze zuivering van ScBor1. Het zuivert in grote hoeveelheden en ziet er gunstige en monodispers op een chromatogram van de SEC, die suggereert dat het een aantrekkelijk doelwit voor structurele studies zou kunnen zijn. Onze cross-linking assay blijkt echter dat er een monomeer wanneer gereinigd. Hoewel het mogelijk is dat ScBor1 native kon bestaan als een monomeer in de cel, blijkt studies dat SLC4 vervoerders en hun homologen waarschijnlijk Dimeren7,8,9,10. Onze ontwikkeling van de cross-linking assay hebben plaatsgevonden na kristalliseren en de structuur van de AtBor1 op te lossen. Echter hadden we kunnen evalueren van ScBor1 in vergelijking met AtBor1 met de cross-linking assay, waardevolle tijd en speurwerk inspanningen kon hebben omgeleid naar de uitoefening van AtBor1 in plaats van ScBor1, de laatste van die uiteindelijk was niet succesvol in kristallisatie en diffractie experimenten. Deze test kan dus helpen onderzoekers onderscheiden homologen of wasmiddelen te gebruiken bij het nastreven van structurele studies om te prioriteren voorwaarden waarin de proteïne de vermoedelijke inheemse conformatie onderhoudt. Bovendien kan de bepaling sonde welke aminozuren zijn essentieel voor multimerization, om te vinden van aminozuur vervangingen die destabiliseren de multimerization interface en leiden tot het verplichten van monomeren worden gebruikt. Een dergelijke aanpak is gebruikt om de sonde van de functionele betekenis van homomeric vergadering in membraan vervoerders16,17,18.
Een algemeen voordeel van onze methode is dat gist is gebleken om de uitdrukking van vele uitdagende membraaneiwitten voor diverse functie1. Bovendien zijn lage kosten en groei tijden reclame maken voor de toegankelijkheid voor vele onderzoeksinspanningen die wellicht minder gebruik maken van strategieën van de expressie waarvoor weefselkweek of dure groei media. De procedures die hier gepresenteerd zijn relatief goedkoop en kunnen worden uitgevoerd in een week waarin de haalbaarheid van de aanpak onderstreept. Uitvoering van deze protocollen kan helpen structurele en functionele bestudering van andere uitdagende membraaneiwitten mogelijk maken.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door opstarten middelen aan Davidson College.
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Imidazole | Acros | 12202 | |
Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |