Induktion af lægemiddelinduceret, autoimmun hepatitis i BALB / c-mus til undersøgelse af dets patogene mekanismer
Summary
Vi beskriver en in vivo immunisering, translationel hepatitis model i BALB / c mus, der kan bruges til at studere patogenesen af lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis, herunder kønsforskelle set i denne sygdom. Vi vil beskrive, hvordan denne model demonstrerer reproducerbare analyser ved hjælp af in vivo og in vitro eksperimentelle teknikker.
Abstract
Lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis (DIH) er den mest almindelige leverlægemiddelinducerede hypersensibiliseringsproces observeret hos ca. 9 til 12% af patienterne med autoimmun hepatitis. Det overvældende flertal af patienter med DIH er kvinder. De underliggende mekanismer for disse kønsforskelle i prævalens er uklare på grund af manglen på dyremodeller, der efterligner menneskelig sygdom. Alligevel menes underliggende mekanismer bredt at være forbundet med humane leukocytantigenhagapityper og kønshormoner. I modsætning hertil har vi ved hjælp af en DIH-musemodel afdækket, at IL-4-initierede CD4 + T-celler rettet mod en epitop af cytokrom P450 2E1 inducerer tilstrømning af neutrofiler, makrofager og mastceller i leveren hos kvindelige BALB / c-mus. Ved hjælp af denne model har vi også vist, at IL-33-inducerede FoxP3+regulatoriske T-celler giver beskyttelse mod DIH hos hun- og hanmus. Denne DIH-model induceres ved immunisering af mus med en epitop af CYP2E1, der er blevet kovalent ændret med en lægemiddelmetabolit, der har været forbundet med DIH. Denne epitop genkendes af patienter med DIH. Vores metode inducerer robust og reproducerbar hepatitis og autoantistoffer, der kan bruges til at studere patogenesen af DIH. Mens in vivo-undersøgelser kan forårsage unødig smerte og angst hos mus, når de udføres forkert, er fordelen ved en in vivo-model evnen til at evaluere patogenesen af sygdom hos et stort antal mus. Derudover kan biologiske virkninger af de ændrede leverproteiner undersøges ved hjælp af invasive procedurer. Tilføjelsen af in vitro-undersøgelser til det eksperimentelle design muliggør hurtig gentagelse og mekanistisk analyse på celleniveau. Således vil vi demonstrere vores modelprotokol, og hvordan den kan bruges til at studere in vivo og in vitro mekanismer af DIH.
Introduction
Formålet med denne metode er at beskrive en musemodel af lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis, der udvikler sig in vivo og demonstrere, hvordan den kan bruges til at undersøge det molekylære, immunologiske og genetiske grundlag for denne sygdom. Det langsigtede mål med vores studier er at afdække mekanismer, der er ansvarlige for udviklingen af kronisk leverbetændelse og skade ved at studere DIH hos modtagelige patienter. Leversygdom og skrumpelever udgør den sjette mest almindelige dødsårsag hos voksne mellem 25 og 64 år. Idiosynkratisk DILI, undertiden benævnt lægemiddelinduceret autoimmun hepatitis (DIH) er den tredje mest almindelige årsag til akut leversvigt i USA. DIH er den mest almindelige leverlægemiddelinducerede hypersensibiliseringsproces observeret hos ca. 9 til 12% af patienterne med autoimmun hepatitis1. Det overvældende flertal af patienter med DIH er kvinder 2,3,4. En type DIH udvikler sig hos modtagelige individer efter administration af halogenerede flygtige anæstetika såsom isofluran, sevofluran, desfluran eller halothan. Disse anæstetika binder kovalent til leverproteiner med reaktive produkter af deres metabolisme, hvilket skaber nye autoantigener, der er i stand til at fremkalde allergiske eller autoimmune reaktioner5.
Undersøgelsen af patogene mekanismer involveret i udviklingen af bedøvelsesmiddel og enhver form for DIH har tidligere været hæmmet af manglen på en dyremodel, der nøje efterligner induktionen af menneskelig sygdom. Vi har udviklet en eksperimentel murinmodel af DIH med funktioner, der ligner immunmedieret DILI hos patienter. Hepatitis induceres ved immunisering med et af to autoantigener, der er blevet kovalent modificeret af trifluoracetylchlorid (TFA) metabolitten, der dannes efter oxidativ metabolisme af bedøvelsesmidlet af enzymet cytokrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Et autoantigen er leverfraktionen af hepatisk cytosolisk S100, som er en blanding af flere proteiner6, og det andet autoantigen er en epitop af CYP2E1, der genkendes af sera fra patienter med bedøvelsesmiddel immunmedieret DILI7. Ved at bruge BALB/c-mus, som er relativt resistente over for eksperimentel autoimmun hepatitis, skelner vi vores model fra den S100-inducerede immuniseringsmodel for autoimmun hepatitis i C57Bl/6J-mus8.
På grund af sine forskellige kliniske præsentationer er DIH vanskelig at studere hos patienter. Translationelle eksperimentelle modeller giver mulighed for at evaluere patogenesen af sygdom in vivo og in vitro. På nuværende tidspunkt er der ingen andre alternative metoder til at inducere DIH, der fuldt ud undersøger in vivo eller in vitro adaptive eller medfødte immunresponser uden brug af dyr. Da trifluoracetylation af S-100 eller CYP2E1-epitopen ikke ser ud til at producere et irriterende immunogen, og vi inducerer DIH ved immunisering med TFA-ændrede proteiner, vil disse dyr ikke modtage ether, halogeneret bedøvelsesmiddel, barbiturat eller alkohol før immunisering eller andre procedurer, i betragtning af at disse midler kan ændre de parametre, vi studerer. Alligevel har vi reduceret vores musebrug ved at bruge computersimulering til at bekræfte bindingspræferencerne for vores opdagede CYP2E1 epitop9 og har spejlet menneskelig DIH, der implicerer kvindelig køn ved at demonstrere, at kvindelige BALB / c-mus udvikler en mere alvorlig DIH10.
På trods af forskellige præsentationer af DIH hos patienter og udfordringer i studiet af klinisk sygdom er posttranslationel modifikation af native proteiner ved reaktive lægemiddelmetabolitter en accepteret nøglemekanisme i patogenesen DIH, der følger halogenerede anæstetika11. Efterforskere accepterer også, at CYP2E1 er et vigtigt autoantigen i denne proces12,13. Rollen af interleukin (IL) -4-opregulerede CD4 + T-celler, der genkender en posttranslationelt modificeret CYP2E1 og andre leverproteiner, er en accepteret initiativtager til bedøvelses-DIH ved at tiltrække neutrofiler, eosinofiler og mastceller i leveren14, og denne mekanisme er blevet bekræftet i mange former for DIH15,16. Inducerede FoxP3-ekspressive CD4 + CD25 + T-celler (Tregs) reducerer sværhedsgraden af DIH, og relative mangler af disse celler i milten forværrer DIH 10,7. Således er de fleste fremskridt inden for forståelse af DIH blevet muliggjort ved at bruge in vivo-musemodeller til at evaluere de genetiske, metaboliske og immunologiske mekanismer i DIH både in vivo og in vitro.
Fordi vi og andre efterforskere har afdækket roller for IL-4, neutrofiler og eosinofiler i initieringen af DIH ved hjælp af forskellige musemodeller, mener vi, at denne observation understøtter vores påstand om, at uanset den anvendte DIH-model induceres hepatitis og skade af IL-4. Styrken i vores protokol ligger i brugen af in vivo-metodologi, både han- og hunmus, og gentagelse af histologi, CD4+ T-celleproliferationsassays og cytokiner. Styrken ved vores brug af in vitro-undersøgelser er, at de reducerer antallet af mus, der er nødvendige, samtidig med at de giver metoden til at isolere cellulære interaktioner, der driver DIH. Vi anbefaler brug af han- og hunmus, fordi dette reducerer muligheden for ubevidst bias i fortolkningen af resultater og styrker oversættelsespotentialet i vores undersøgelser, da forekomsten, prævalensen og sværhedsgraden af DIH er højere hos kvinder17 år. Vi anbefaler, at mus fås fra en enkelt leverandør; Men hvis dette ikke er muligt, skal du få kuldkammeratkontroller eller vildtypemus fra samme leverandør som de genetisk ændrede mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Styrken af denne protokol hviler i dens reproducerbarhed; så det er vigtigt at overholde de foreslåede trin. Formulering af immunogen kan være en barriere for nogle; Vi har dog gengivet vores model ved hjælp af epitopen beskrevet i vores dokument, hvilket fjerner behovet for at isolere S100-fraktionen af leveren. Det er sandsynligt, at yderligere epitoper eller proteiner kan ændres og fremkalde hepatitis efter immuniseringer; Vi beskriver dog de proteiner, som vi har brugt med pålidelige resultater. Flere proteiner…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Njoku vil gerne anerkende Dr. Noel R. Rose, MD PhD, for hans vejledning og indsigtsfulde diskussioner, der resulterede i formuleringen af denne model.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
Referências
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
