Induction d’une hépatite auto-immune induite par des médicaments chez des souris BALB/c pour l’étude de ses mécanismes pathogènes
Summary
Nous décrivons un modèle d’hépatite translationnelle d’immunisation in vivo chez des souris BALB/c qui peut être utilisé pour étudier la pathogenèse de l’hépatite auto-immune induite par les médicaments, y compris les différences entre les sexes observées dans cette maladie. Nous décrirons comment ce modèle démontre des analyses reproductibles à l’aide de techniques expérimentales in vivo et in vitro.
Abstract
L’hépatite auto-immune induite par les médicaments (DIH) est le processus d’hypersensibilisation hépatique induit par les médicaments le plus courant observé chez environ 9 à 12% des patients atteints d’hépatite auto-immune. L’écrasante majorité des patients atteints de DIH sont des femmes. Les mécanismes sous-jacents de ces différences de prévalence entre les sexes ne sont pas clairs en raison de la rareté des modèles animaux qui imitent la maladie humaine. Malgré cela, les mécanismes sous-jacents sont largement considérés comme associés aux haplotypes d’antigènes leucocytaires humains et aux hormones sexuelles. En revanche, en utilisant un modèle murin DIH, nous avons découvert que les lymphocytes T CD4+ initiés par l’IL-4 dirigés contre un épitope du cytochrome P450 2E1 induisent un afflux de neutrophiles, de macrophages et de mastocytes dans le foie de souris BALB/c femelles. En utilisant ce modèle, nous avons également montré que les lymphocytes T FoxP3+ régulateurs induits par l’IL-33 confèrent une protection contre le DIH chez les souris femelles et mâles. Ce modèle DIH est induit par l’immunisation de souris avec un épitope de CYP2E1 qui a été modifié de manière covalente avec un métabolite médicamenteux qui a été associé au DIH. Cet épitope est reconnu par les patients atteints de DIH. Notre méthode induit une hépatite robuste et reproductible et des auto-anticorps qui peuvent être utilisés pour étudier la pathogenèse du DIH. Alors que les études in vivo peuvent causer une douleur et une détresse excessives chez la souris lorsqu’elles sont mal effectuées, l’avantage d’un modèle in vivo est la capacité d’évaluer la pathogenèse de la maladie chez un grand nombre de souris. De plus, les effets biologiques des protéines hépatiques altérées peuvent être étudiés à l’aide de procédures invasives. L’ajout d’études in vitro à la conception expérimentale permet une répétition rapide et une analyse mécaniste au niveau cellulaire. Ainsi, nous démontrerons notre protocole modèle et comment il peut être utilisé pour étudier in vivo et in vitro les mécanismes du DIH.
Introduction
Le but de cette méthode est de décrire un modèle murin d’hépatite auto-immune induite par un médicament qui se développe in vivo et de démontrer comment il peut être utilisé pour étudier les bases moléculaires, immunologiques et génétiques de cette maladie. L’objectif à long terme de nos études est de découvrir les mécanismes responsables du développement de l’inflammation chronique du foie et des lésions en étudiant le DIH chez les patients sensibles. Les maladies du foie et la cirrhose constituent la sixième cause de décès chez les adultes âgés de 25 à 64 ans. Le DILI idiosyncratique, parfois appelé hépatite auto-immune induite par les médicaments (DIH), est la troisième cause la plus fréquente d’insuffisance hépatique aiguë aux États-Unis. Le DIH est le processus d’hypersensibilisation hépatique induit par les médicaments le plus courant observé chez environ 9 à 12% des patients atteints d’hépatiteauto-immune 1. L’écrasante majorité des patients atteints de DIH sont des femmes 2,3,4. Un type de DIH se développe chez les personnes sensibles après l’administration d’anesthésiques volatils halogénés tels que l’isoflurane, le sévoflurane, le desflurane ou l’halothane. Ces anesthésiques se lient de manière covalente aux protéines hépatiques avec des produits réactifs de leur métabolisme, créant ainsi de nouveaux autoantigènes capables de provoquer des réponses allergiques ou auto-immunes5.
L’étude des mécanismes pathogènes impliqués dans le développement de l’anesthésique et de toute forme de DIH a déjà été entravée par l’absence d’un modèle animal qui imite étroitement l’induction de la maladie humaine. Nous avons développé un modèle murin expérimental de DIH avec des caractéristiques ressemblant à DILI à médiation immunitaire chez les patients. L’hépatite est induite par l’immunisation avec l’un des deux autoantigènes qui ont été modifiés de manière covalente par le métabolite du chlorure de trifluoroacétyle (TFA) qui se forme à la suite du métabolisme oxydatif de l’anesthésique par l’enzyme cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantigène est la fraction hépatique cytosolique hépatique S100, qui est un mélange de plusieurs protéines6, et le second autoantigène est un épitope du CYP2E1 qui est reconnu par les sérums de patients atteints de DILI7 à médiation immunitaire anesthésique. En utilisant des souris BALB/c, qui sont relativement résistantes à l’hépatite auto-immune expérimentale, nous distinguons notre modèle du modèle d’immunisation induite par S100 de l’hépatite auto-immune chez les souris C57Bl/6J8.
En raison de ses diverses présentations cliniques, le DIH est difficile à étudier chez les patients. Les modèles expérimentaux translationnels offrent la possibilité d’évaluer la pathogenèse de la maladie in vivo et in vitro. À l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour induire le DIH qui examinent pleinement in vivo ou in vitro les réponses immunitaires adaptatives ou innées sans l’utilisation d’animaux. De plus, étant donné que la trifluoroacétylation du S-100 ou de l’épitope CYP2E1 ne semble pas produire d’immunogène irritant et que nous induisons le DIH par immunisation avec des protéines altérées par le TFA, ces animaux ne recevront pas d’éther, d’anesthésique halogéné, de barbiturique ou d’alcool avant l’immunisation ou d’autres procédures, étant donné que ces agents peuvent modifier les paramètres que nous étudions. Malgré cela, nous avons réduit notre utilisation de souris en utilisant la simulation informatique pour confirmer les préférences de liaison de notre épitope9 CYP2E1 découvert et avons reflété le DIH humain impliquant le sexe féminin en démontrant que les souris FEMELLES BALB / c développent un DIH10 plus sévère.
Malgré les diverses présentations du DIH chez les patients et les défis dans l’étude de la maladie clinique, la modification post-traductionnelle des protéines natives par les métabolites réactifs des médicaments est un mécanisme clé accepté dans la pathogenèse DIH qui suit les anesthésiques halogénés11. Les chercheurs admettent également que le CYP2E1 est un autoantigène majeur dans ce processus12,13. Le rôle des lymphocytes T CD4+régulés à la hausse par l’interleukine (IL)-4 qui reconnaissent un CYP2E1 modifié post-traductionnellement et d’autres protéines hépatiques est un initiateur accepté du DIH anesthésique en attirant les neutrophiles, les éosinophiles et les mastocytes dans le foie14, et ce mécanisme a été confirmé dans de nombreuses formes de DIH15,16. Les lymphocytes T CD4+CD25+T (Tregs) exprimant FoxP3 induits réduisent la gravité de la DIH, et les déficiences relatives de ces cellules dans la rate aggravent la DIH 10,7. Ainsi, la majorité des progrès dans la compréhension du DIH ont été rendus possibles en utilisant des modèles murins in vivo pour évaluer les mécanismes génétiques, métaboliques et immunologiques du DIH in vivo et in vitro.
Étant donné que nous et d’autres chercheurs avons découvert des rôles pour l’IL-4, les neutrophiles et les éosinophiles dans l’initiation du DIH en utilisant différents modèles murins, nous pensons que cette observation appuie notre affirmation selon laquelle, quel que soit le modèle DIH utilisé, l’hépatite et les blessures sont induites par l’IL-4. La force de notre protocole réside dans l’utilisation de la méthodologie in vivo, à la fois des souris mâles et femelles, et la répétition de l’histologie, des tests de prolifération des lymphocytes T CD4+ et des cytokines. La force de notre utilisation des études in vitro est qu’elles réduisent le nombre de souris nécessaires tout en fournissant la méthodologie pour isoler les interactions cellulaires qui conduisent au DIH. Nous recommandons l’utilisation de souris mâles et femelles, car cela réduit la possibilité de biais inconscients dans l’interprétation des résultats et renforce le potentiel de traduction de nos études puisque l’incidence, la prévalence et la gravité du DIH sont plus élevées chez les femmes17. Nous recommandons que les souris soient obtenues auprès d’un seul fournisseur; toutefois, si cela n’est pas possible, procurez-vous des témoins de compagnons de litière ou des souris de type sauvage auprès du même fournisseur que les souris génétiquement modifiées.
Protocol
Representative Results
Discussion
La force de ce protocole réside dans sa reproductibilité; il est donc essentiel de respecter les étapes suggérées. La formulation de l’immunogène peut être une barrière pour certains; cependant, nous avons reproduit notre modèle en utilisant l’épitope décrit dans notre document, ce qui élimine le besoin d’isoler la fraction S100 du foie. Il est probable que des épitopes ou des protéines supplémentaires peuvent être modifiés et induire une hépatite après les vaccinations; cependant, nous décrivon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le Dr Njoku tient à remercier le Dr Noel R. Rose, MD PhD, pour ses conseils et ses discussions perspicaces qui ont abouti à la formulation de ce modèle.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
Referências
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