Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen
Summary
Wir beschreiben ein in vivo Immunisierungs-, translationales Hepatitis-Modell bei BALB / c-Mäusen, das verwendet werden kann, um die Pathogenese der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis einschließlich der bei dieser Krankheit beobachteten Geschlechtsunterschiede zu untersuchen. Wir werden beschreiben, wie dieses Modell reproduzierbare Analysen mit experimentellen In-vivo- und In-vitro-Techniken demonstriert.
Abstract
Die medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Geschlechtsunterschiede in der Prävalenz sind unklar, da Tiermodelle, die menschliche Krankheiten nachahmen, fehlen. Dennoch wird allgemein angenommen, dass zugrunde liegende Mechanismen mit menschlichen Leukozyten-Antigen-Haplotypen und Sexualhormonen in Verbindung gebracht werden. Im Gegensatz dazu haben wir mit einem DIH-Mausmodell herausgefunden, dass IL-4-initiierte CD4 + T-Zellen, die gegen ein Epitop von Cytochrom P450 2E1 gerichtet sind, den Zustrom von Neutrophilen, Makrophagen und Mastzellen in die Lebern weiblicher BALB / c-Mäuse induzieren. Mit diesem Modell haben wir auch gezeigt, dass IL-33-induzierte FoxP3+regulatorische T-Zellen Schutz gegen DIH bei weiblichen und männlichen Mäusen bieten. Dieses DIH-Modell wird durch die Immunisierung von Mäusen mit einem Epitop von CYP2E1 induziert, das kovalent mit einem Arzneimittelmetaboliten verändert wurde, der mit DIH assoziiert wurde. Dieses Epitop wird von Patienten mit DIH erkannt. Unsere Methode induziert robuste und reproduzierbare Hepatitis- und Autoantikörper, die zur Untersuchung der Pathogenese von DIH verwendet werden können. Während In-vivo-Studien bei Mäusen übermäßige Schmerzen und Leiden verursachen können, wenn sie unsachgemäß durchgeführt werden, besteht der Vorteil eines In-vivo-Modells in der Fähigkeit, die Krankheitserregung bei einer großen Anzahl von Mäusen zu bewerten. Zusätzlich können biologische Effekte der veränderten Leberproteine mit invasiven Verfahren untersucht werden. Die Ergänzung des experimentellen Designs um In-vitro-Studien ermöglicht eine schnelle Wiederholung und mechanistische Analyse auf zellulärer Ebene. So werden wir unser Modellprotokoll demonstrieren und wie es verwendet werden kann, um In-vivo- und In-vitro-Mechanismen von DIH zu untersuchen.
Introduction
Der Zweck dieser Methode ist es, ein Mausmodell der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis zu beschreiben, das sich in vivo entwickelt, und zu zeigen, wie es verwendet werden kann, um die molekularen, immunologischen und genetischen Grundlagen dieser Krankheit zu untersuchen. Das langfristige Ziel unserer Studien ist es, Mechanismen aufzudecken, die für die Entstehung chronischer Leberentzündungen und -verletzungen verantwortlich sind, indem wir DIH bei anfälligen Patienten untersuchen. Lebererkrankungen und Zirrhose stellen die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren dar. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) bezeichnet, ist die dritthäufigste Ursache für akutes Leberversagen in den Vereinigten Staaten. DIH ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis1 beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen 2,3,4. Eine Art von DIH entwickelt sich bei anfälligen Personen nach Verabreichung von halogenierten flüchtigen Anästhetika wie Isofluran, Sevofluran, Desfluran oder Halothan. Diese Anästhetika binden kovalent an Leberproteine mit reaktiven Produkten ihres Stoffwechsels und erzeugen so neuartige Autoantigene, die allergische oder Autoimmunreaktionen hervorrufenkönnen 5.
Die Untersuchung pathogener Mechanismen, die an der Entwicklung von Anästhetika und jeder Form von DIH beteiligt sind, wurde zuvor durch das Fehlen eines Tiermodells behindert, das die Induktion menschlicher Krankheiten genau nachahmt. Wir haben ein experimentelles murines Modell von DIH mit Merkmalen entwickelt, die immunvermitteltem DILI bei Patienten ähneln. Hepatitis wird durch Immunisierung mit einem von zwei Autoantigenen induziert, die kovalent durch den Trifluoracetylchlorid (TFA)-Metaboliten modifiziert wurden, der nach oxidativem Metabolismus des Anästhetikums durch das Enzym Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)5 gebildet wird. Ein Autoantigen ist die hepatische zytosolische S100-Leberfraktion, die eine Mischung aus mehreren Proteinen6 ist, und das zweite Autoantigen ist ein Epitop von CYP2E1, das von Seren bei Patienten mit immunvermitteltem Anästhesie-DILI7 erkannt wird. Durch die Verwendung von BALB/c-Mäusen, die relativ resistent gegen experimentelle Autoimmunhepatitis sind, unterscheiden wir unser Modell vom S100-induzierten Immunisierungsmodell der Autoimmunhepatitis bei C57Bl/6J-Mäusen8.
Aufgrund seiner vielfältigen klinischen Präsentationen ist das DIH bei Patienten schwer zu untersuchen. Translationale experimentelle Modelle bieten die Möglichkeit, die Pathogenese der Krankheit in vivo und in vitro zu bewerten. Derzeit gibt es keine anderen alternativen Methoden zur Induktion von DIH, die in vivo oder in vitro adaptive oder angeborene Immunantworten ohne den Einsatz von Tieren vollständig untersuchen. Da die Trifluoracetylierung von S-100 oder dem CYP2E1-Epitop kein irritierendes Immunogen zu produzieren scheint und wir DIH durch Immunisierung mit TFA-veränderten Proteinen induzieren, erhalten diese Tiere vor der Immunisierung oder anderen Verfahren keinen Ether, halogenierte Anästhetika, Barbiturat oder Alkohol, da diese Mittel die von uns untersuchten Parameter verändern können. Trotzdem haben wir unseren Mausverbrauch reduziert, indem wir Computersimulationen verwendet haben, um die Bindungspräferenzen unseres entdeckten CYP2E1-Epitops 9 zu bestätigen, und haben menschliches DIH gespiegelt, das weibliches Geschlecht impliziert, indem wir gezeigt haben, dass weibliche BALB / c-Mäuse einen schwereren DIH10 entwickeln.
Trotz vielfältiger Darstellungen von DIH bei Patienten und Herausforderungen bei der Erforschung klinischer Erkrankungen ist die posttranslationale Modifikation nativer Proteine durch reaktive Wirkstoffmetaboliten ein anerkannter Schlüsselmechanismus in der Pathogenese DIH, die auf halogenierte Anästhetika folgt11. Die Forscher akzeptieren auch, dass CYP2E1 ein wichtiges Autoantigen in diesem Prozessist 12,13. Die Rolle von Interleukin (IL)-4-upregulierten CD4+T-Zellen, die ein posttranslational modifiziertes CYP2E1 und andere Leberproteine erkennen, ist ein akzeptierter Initiator von anästhetischem DIH, indem sie Neutrophile, Eosinophile und Mastzellen in die Leber 14 lockt, und dieser Mechanismus wurde in vielen Formen von DIH 15,16 bestätigt. Induzierte FoxP3-exprimierende CD4+CD25+T-Zellen (Tregs) reduzieren den Schweregrad von DIH, und relative Mängel dieser Zellen in der Milz verschlimmern DIH 10,7. So wurden die meisten Fortschritte beim Verständnis von DIH durch die Verwendung von In-vivo-Mausmodellen ermöglicht, um die genetischen, metabolischen und immunologischen Mechanismen von DIH sowohl in vivo als auch in vitro zu bewerten.
Da wir und andere Forscher Rollen für IL-4, Neutrophile und Eosinophile bei der Initiierung von DIH mit verschiedenen Mausmodellen aufgedeckt haben, glauben wir, dass diese Beobachtung unsere Behauptung stützt, dass unabhängig vom verwendeten DIH-Modell Hepatitis und Verletzung durch IL-4 induziert werden. Die Stärke unseres Protokolls liegt in der Anwendung der In-vivo-Methodik, sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse, und der Wiederholung von Histologie, CD4+ T-Zell-Proliferationsassays und Zytokinen. Die Stärke unserer Verwendung von In-vitro-Studien besteht darin, dass sie die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren und gleichzeitig die Methodik zur Isolierung zellulärer Interaktionen bereitstellen, die DIH antreiben. Wir empfehlen die Verwendung von männlichen und weiblichen Mäusen, da dies die Möglichkeit einer unbewussten Verzerrung bei der Interpretation der Ergebnisse verringert und das Übersetzungspotenzial unserer Studien stärkt, da die Inzidenz, Prävalenz und Schwere von DIH bei Frauen17 höher ist. Wir empfehlen, dass Mäuse von einem einzigen Anbieter bezogen werden; Wenn dies jedoch nicht möglich ist, besorgen Sie sich Wurfpartnerkontrollen oder Wildtyp-Mäuse vom selben Anbieter wie die genetisch veränderten Mäuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Reproduzierbarkeit; Daher ist es wichtig, sich an die vorgeschlagenen Schritte zu halten. Die Formulierung des Immunogens kann für einige eine Barriere sein; Wir haben unser Modell jedoch mit dem in unserem Dokument beschriebenen Epitop reproduziert, wodurch die Notwendigkeit, die S100-Fraktion der Leber zu isolieren, entfällt. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Epitope oder Proteine nach Impfungen verändert werden können und Hepatitis induzieren; Wir beschreiben je…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Njoku möchte Dr. Noel R. Rose, MD PhD, für seine Anleitung und aufschlussreichen Diskussionen danken, die zur Formulierung dieses Modells geführt haben.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
Referências
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