Denne metode giver en måde at par optogenetics og genetisk kodet calcium sensorer til billede baseline cytosolisk calcium niveauer og ændringer i fremkaldte calcium transienter i kroppen væg muskler af model organismen C. elegans.
Den model organisme C. elegans giver et fremragende system til at udføre in vivo calcium Imaging. Dens gennemsigtige krop og genetiske manipulerbarhed giver mulighed for målrettet ekspression af genetisk kodede calcium sensorer. Denne protokol skitserer brugen af disse sensorer til in vivo billeddannelse af calcium dynamik i målrettede celler, specifikt kroppens væg muskler af orme. Ved at udnytte Co-ekspression af præsynaptic channelrhodopsin, stimulering af acetylcholin frigivelse fra excitatoriske motor neuroner kan induceres ved hjælp af blå lys impulser, resulterer i muskel depolarisering og reproducerbare ændringer i cytoplasmisk calcium Niveauer. To orm immobilisering teknikker diskuteres med varierende sværhedsgrader. En sammenligning af disse teknikker viser, at begge metoder bevarer det neuromuskulære omvejnings fysiologi og muliggør reproducerbar kvantificering af calcium transienter. Ved parring optogenetics og funktionelle calcium Imaging, ændringer i post Synaptic calcium håndtering og homøostase kan evalueres i en række mutante baggrunde. Data præsenteret validerer både immobilisering teknikker og specifikt undersøger rollerne af C. elegans sarco (endo) plasmic retikulære calcium ATPase og Calcium-aktiverede BK kalium kanal i kroppen væg muskel calcium forordning.
Dette papir præsenterer metoder til in vivo calcium Imaging af C. elegans kropsvæg muskler ved hjælp af optogenetisk neuronal stimulation. Parring af en muskel udtrykte genetisk kodet calcium indikator (GECI) med blåt lys udløst neuronal depolarisering og giver et system til klart at observere de fremkaldte postsynaptiske calcium transienter. Dette undgår brugen af elektrisk stimulation, tillader en ikke-invasiv analyse af mutanter påvirker den postsynaptiske calcium dynamik.
Enkelt-fluorophore GECIs, såsom GCaMP, bruger et enkelt fluorescerende protein molekyle smeltet til M13 domæne af myosin lyskæde kinase ved sin N-terminal ende og calmodulin (CaM) på C-Terminus. Ved calcium binding gennemgår CaM-domænet, som har en høj affinitet for calcium, en konformationel ændring, der inducerer en efterfølgende konformationel ændring i det fluorescerende protein, hvilket fører til en stigning i fluorescens intensitet1. GCaMP Fluorescens er spændt på 488 nm, hvilket gør det uegnet til at blive brugt i forbindelse med channelrhodopsin, som har en lignende excitation bølgelængde på 473 nm. Således, for at par calcium målinger med channelrhodopsin stimulation, det grønne fluorescerende protein af GCaMP skal udskiftes med et rødt fluorescerende protein, mRuby (RCaMP). Ved hjælp af musklen udtrykte RCaMP, i kombination med den kolinerge motor neuron ekspression af channelrhodopsin, tillader undersøgelser på ormen neuromuskulære Junction (NMJ) med samtidig brug af optogenetik og funktionel billeddannelse inden for samme dyr 2.
Brugen af channelrhodopsin omgår behovet for elektrisk stimulation til at depolarisere de neuromuskulære kryds af C. elegans, som kun kan opnås i dissekeret præparater, hvilket gør denne teknik både lettere at ansætte og mere præcis ved målretning af specifikke væv. For eksempel, channelrhodopsin er tidligere blevet brugt i C. elegans at reversibelt aktivere specifikke neuroner, fører til enten robust aktivering af excitatoriske eller hæmmende neuroner3,4. Brugen af lys-stimuleret depolarisering også omgår spørgsmålet om neuronal skade på grund af den direkte elektriske stimulation. Dette giver mulighed for at undersøge virkningerne af mange forskellige stimulerings protokoller, herunder vedvarende og gentagne stimuleringer, på postsynaptisk calcium dynamik4.
C. elegans ‘ gennemsigtige karakter gør den ideel til den funktionelle analyse af fluorescerende billeder. Men, når stimulere excitatoriske acetylcholin neuroner på NMJ, dyr forventes at reagere med en umiddelbar muskelsammentrækning4, gør immobilisering af orme kritisk i visualisering af diskrete calcium ændringer. Traditionelt er farmakologiske midler blevet brugt til at lamme dyrene. En sådan stof anvendes er levamisole, en kolinerge acetylcholin receptor agonist5,6,7. Da levamisol fører til vedvarende aktivering af en under type af excitatoriske muskel receptorer, er dette reagens uegnet til studiet af muskel calcium dynamikken. Virkningen af levamisol inducerer postsynaptisk depolarisering, opløstende cytosolisk calcium, og occherunder observationer efter præsynaptisk stimulation. For at undgå brug af paralyserende lægemidler, vi undersøgte to alternative metoder til at immobilisere C. elegans. Dyr blev enten limet ned og derefter dissekeret åben for at udsætte kroppen væg muskler, svarende til den eksisterende C. elegans nmj Elektrofysiologi metode8, eller nanobeads blev brugt til at imprere intakte dyr9. Begge procedurer tilladt for reproducerbare målinger af hvile og fremkaldte muskel calcium transienter, der var let kvantificerbare.
Metoderne i dette papir kan bruges til at måle baseline cytosolisk calcium niveauer og transienter i postsynaptiske kropsvæg muskelceller i C. elegans. Eksempler på data, der anvender de to forskellige immobilisering teknikker er givet. Begge teknikker drage fordel af optogenetics at depolarisere muskelcellerne uden brug af elektrisk stimulation. Disse eksempler demonstrere gennemførligheden af denne metode i vurderingen af mutationer, der påvirker postsynaptisk calcium håndtering i orme og påpege fordele og ulemper ved de to immobilisering tilgange.
GECIs er et kraftfuldt værktøj i C. elegans neurobiologi. Tidligere arbejde har udnyttet calcium Imaging teknikker til at undersøge en bred vifte af funktioner i både neuroner og muskelceller, herunder sensoriske og adfærdsmæssige reaktioner, med varierede metoder til stimulation. Nogle undersøgelser har brugt kemiske stimuli til at udløse calcium transienter i sensoriske aske neuroner22,23 eller til at fremkalde calcium bølger i faryngealt musk…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Alexander Gottschalk for ZX1659, RCaMP og channelrhodopsin indeholdende orm stamme, Dr. Hongkyun Kim for SLO-1 (eg142) orm stamme, og det nationale Bioresource projekt for SCA-1 (tm5339) orm stamme.
all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
Amber LED | RCaMP illumination | ||
Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |