In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren
Summary
Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.
Abstract
Het modelorganisme C. elegans biedt een uitstekend systeem om in vivo calcium beeldvorming uit te voeren. Het transparante lichaam en de genetische manipulability zorgen voor de gerichte expressie van genetisch gecodeerde calcium sensoren. Dit protocol schetst het gebruik van deze sensoren voor de in vivo beeldvorming van de calcium dynamica in gerichte cellen, met name de lichaamsspieren van de wormen. Door gebruik te maken van de co-expressie van presynaptische channelrhodopsin, stimulatie van acetylcholine vrijlating van excitatory motorneuronen kan worden geïnduceerd met behulp van blauw lichtpulsen, resulterend in spier depolarisatie en reproduceerbare veranderingen in cytoplasmatische calcium Niveaus. Twee worm immobilisatie technieken worden besproken met verschillende moeilijkheidsgraden. Vergelijking van deze technieken toont aan dat beide benaderingen de Fysiologie van het neuromusculaire knooppunt behouden en de reproduceerbare kwantificering van calcium transiënten mogelijk maken. Door optogenetica en functionele calcium beeldvorming te koppelen, kunnen veranderingen in postsynaptische calcium behandeling en homeostase worden geëvalueerd in een verscheidenheid aan Mutante achtergronden. Gepresenteerde gegevens valideert zowel immobilisatie technieken en onderzoekt specifiek de rollen van de C. elegans Sarco (endo) plasmische Reculaire calcium ATPase en het calcium-geactiveerde BK kalium kanaal in de Body Wall muscle calcium regulatie.
Introduction
Dit document presenteert methoden voor in vivo calcium beeldvorming van C. elegans lichaam wand spieren met behulp van optogenetische neuronale stimulatie. Het koppelen van een spier uitgedrukt genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI) met blauw licht veroorzaakte neuronale depolarisatie en biedt een systeem om de Evoked postsynaptisch calcium transiënten duidelijk te observeren. Dit vermijdt het gebruik van elektrische stimulatie, waardoor een niet-invasieve analyse van mutanten die de postsynaptische calcium dynamiek beïnvloeden.
Single-fluorophore GECIs, zoals GCaMP, maakt gebruik van een enkele fluorescerende proteïne molecuul gesmolten tot de M13 domein van myosin Light Chain kinase aan de N-Terminal einde en Calmoduline (CaM) op de C-Terminus. Bij calcium binding ondergaat het CaM-domein, dat een hoge affiniteit heeft met calcium, een conformationele verandering die een daaropvolgende conformationele verandering in het fluorescerende eiwit veroorzaakt, wat leidt tot een toename van de intensiteit van de fluorescentie1. GCaMP fluorescentie is opgewonden op 488 nm, waardoor het ongeschikt is om te worden gebruikt in combinatie met channelrhodopsin, die een vergelijkbare excitatie golflengte van 473 nm heeft. Daarom moet het groene fluorescerende eiwit van GCaMP worden vervangen door een rood fluorescerende proteïne, mRuby (RCaMP), om de calcium metingen met channelrhodopsine stimulatie te kunnen koppel. Met behulp van de spier uitgedrukt RCaMP, in combinatie met de cholinerge motorische neuron expressie van channelrhodopsin, maakt studies mogelijk op de worm neuromusculaire kruising (NMJ) met gelijktijdig gebruik van optogenetica en functionele beeldvorming binnen hetzelfde dier 2.
Het gebruik van channelrhodopsin omzeilt de noodzaak van de elektrische stimulatie om de neuromusculaire knooppunten van C. eleganste depolariseren, wat alleen kan worden bereikt in ontleed preparaten, waardoor deze techniek zowel eenvoudiger in gebruik en preciezer bij het targeten van specifieke weefsels. Bijvoorbeeld, channelrhodopsin is eerder gebruikt in C. elegans om reversibel activeren specifieke neuronen, leidt tot ofwel robuuste activering van excitatory of remmende neuronen3,4. Het gebruik van lichtgestimuleerde depolarisatie omzeilt ook de kwestie van neuronale schade als gevolg van de directe elektrische stimulatie. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van veel verschillende stimulatie protocollen, met inbegrip van aanhoudende en herhaalde stimulaties, op postsynaptisch calcium Dynamics4te onderzoeken.
Het transparante karakter van C. elegans maakt het ideaal voor de fluorescerende beeldvormende functionaalanalyse. Echter, bij het stimuleren van de excitatory acetylcholine neuronen op de NMJ, dieren worden verwacht te reageren met een onmiddellijke spiercontractie4, waardoor de immobilisatie van de wormen kritisch in het visualiseren van discrete calcium veranderingen. Traditioneel, farmacologische agenten zijn gebruikt voor het verlammen van de dieren. Een dergelijke drug gebruikt is Levamisole, een cholinerge acetylcholine receptor agonist5,6,7. Aangezien levamisol leidt tot de aanhoudende activering van een subtype van excitatory spier receptoren, is dit reagens ongeschikt voor de studie van de spier calcium dynamiek. De werking van levamisol induceert postsynaptische depolarisatie, verheffende het cytosolische calcium en occluderende waarnemingen na presynaptische stimulatie. Om het gebruik van verlamde drugs te voorkomen, we onderzochten twee alternatieve methoden om te immobiliseren C. elegans. Dieren werden ofwel gelijmd en vervolgens ontleed open om de lichaamsspieren bloot te stellen, vergelijkbaar met de bestaande C. elegans nmj elektrofysiologie methode8, of nano kralen werden gebruikt om intacte dieren te immobiliseren9. Beide procedures toegestaan voor de reproduceerbare metingen van de rust en Evoked spier calcium transiënten die gemakkelijk kwantificeerbaar waren.
De methoden in dit papier kunnen worden gebruikt om de baseline cytosolische calciumspiegels en transiënten in postsynaptisch Body Wall spiercellen in C. eleganste meten. Voorbeelden van gegevens met de twee verschillende immobilisatie technieken worden gegeven. Beide technieken maken gebruik van optogenetics om de spiercellen te depolariseren zonder het gebruik van elektrische stimulatie. Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van deze methode aan bij het evalueren van mutaties die de postsynaptische behandeling van calcium in de wormen beïnvloeden en wijzen op de voors en tegens van de twee immobilisatie benaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs zijn een krachtig hulpmiddel in C. elegans neurobiologie. Vorige werk heeft gebruikt calcium Imaging technieken om een breed scala van functies in zowel neuronen en spiercellen, met inbegrip van zintuiglijke en gedragsmatige reacties, met gevarieerde methoden van stimulatie te onderzoeken. Sommige studies hebben chemische stimuli gebruikt om te leiden tot calcium transiënten in sensorische as neuronen22,23 of voor het opwekken van calcium golven i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Alexander Gottschalk voor ZX1659, de RCaMP en channelrhodopsin met worm stam, Dr. Hongkyun Kim voor de SLO-1 (eg142) worm stam, en het nationale Bioresource project voor de SCA-1 (tm5339) worm stam.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
Referências
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genética. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
