В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела
Summary
Этот метод обеспечивает способ для пары оптогенетики и генетически закодированных датчиков кальция для изображения базовых уровней цитосолика кальция и изменения в вызванных переходных кальция в мышцах стенки тела модельного организма C. elegans.
Abstract
Модель организма C. elegans обеспечивает отличную систему для выполнения виво-изображения кальция. Его прозрачное тело и генетическая манипулируемость позволяют целенаправленно выражать генетически закодированные датчики кальция. Этот протокол описывает использование этих датчиков для in vivo изображения динамики кальция в целевых клетках, в частности, мышцы стенки тела червей. Используя совместное выражение пресинаптического каналародопсина, стимуляция ацетилхолина от возбуждающих моторных нейронов может быть индуцирована с помощью импульсов синего света, что приводит к деполяризации мышц и воспроизводимым изменениям цитоплазмического кальция Уровней. Два червя иммобилизации методы обсуждаются с различными уровнями сложности. Сравнение этих методов показывает, что оба подхода сохраняют физиологию нервно-мышечного соединения и позволяют воспроизводимую количественную оценку переходных кальция. При сопряжении оптогенетики и функциональной визуализации кальция, изменения в постсинаптической обработки кальция и гомеостаза могут быть оценены в различных мутантных фонов. Представленные данные подтверждают как методы иммобилизации, так и конкретно рассматривают сяосматривает роли C. elegans sarco (endo)plasmic reticular calcium ATPase и кальциевый канал BK калия в регуляции кальция мышцы стенки тела.
Introduction
В этой статье представлены методы для in vivo изображения кальция C. elegans мышцстены тела с использованием оптогенетической стимуляции нейронов. Сопряжение мышцы, выраженной генетически закодированным индикатором кальция (GECI) с синим светом, спровоцировав нейрональную деполяризацию и обеспечивает систему для четкого наблюдения вызываемых постсинаптических переходных кальций. Это позволяет избежать использования электрической стимуляции, что позволяет неинвазивный анализ мутантов, влияющих на динамику постсинаптического кальция.
Однофторофорные ГКИ, такие как GCaMP, используют одну флуоресцентную молекулу белка, сливную с доменом M13 миозиновой легкой цепи киназы в конце N-терминала и стодулина (CAM) в C-терминине. После связывания кальция, домен CaM, который имеет высокое сродство к кальцию, подвергается конформационным изменениям, вызывая последующее конформационное изменение флуоресцентного белка, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции1. GCaMP флуоресценция возбужденных на 488 нм, что делает его непригодным для использования в сочетании с channelrhodopsin, который имеет аналогичную длину волн возбуждения 473 нм. Таким образом, для того, чтобы соединить измерения кальция со стимуляцией channelrhodopsin, зеленый флуоресцентный белок GCAMP должен быть заменен красным флуоресцентным белком, мруби (RCaMP). Использование мышцы выразилRCaMP, в сочетании с холинергической двигательной нейронной экспрессии channelrhodopsin, позволяет исследования на червя нервно-мышечного соединения (NMJ) с одновременным использованием оптогенетики и функциональной визуализации в рамках одного и того же животного 2.
Использование channelrhodopsin обходит необходимость электрической стимуляции для деполяризации нервно-мышечных соединений C. elegans, которые могут быть достигнуты только в расчлененных препаратов, что делает этот метод как легче использовать и более точным при ориентации на конкретные ткани. Например, channelrhodopsin ранее был использован в C. elegans для обратимой активации конкретных нейронов, что приводит либо к надежной активации возбуждательных или ингибирующих нейронов3,4. Использование светостимулируемой деполяризации также обходит вопрос о повреждении нейронов из-за прямой электрической стимуляции. Это дает возможность изучить влияние многих различных протоколов стимуляции, в том числе устойчивых и повторяющихся стимуляций, на постсинаптической динамике кальция4.
Прозрачный характер C. elegans делает его идеальным для флуоресцентного изображения функционального анализа. Однако, при стимулировании возбуждающих ацетилхолина нейронов на NMJ, животные, как ожидается, реагировать с немедленной сокращения мышц4, что делает иммобилизацию червей решающее значение в визуализации дискретных изменений кальция. Традиционно, фармакологические агенты были использованы, чтобы парализовать животных. Одним из таких препаратов используется левамизол, холинергический ацетилхолин рецептор агониста5,6,7. Так как левамизол приводит к постоянной активации подтипа возбуждающих мышечных рецепторов, этот реагент не подходит для изучения динамики мышечного кальция. Действие левамизола вызывает постинаптическую деполяризацию, повышение цитозолического кальция и окклюзионные наблюдения после пресинаптической стимуляции. Чтобы избежать применения парализующих препаратов, мы рассмотрели два альтернативных метода обездвиживания C. elegans. Звери были либо склеены, а затем расчленены открытыми, чтобы разоблачить мышцы стенки тела, похожие на существующие C. elegans NMJ электрофизиологии метод8, или нанобусы были использованы для обездвиживания нетронутых животных9. Обе процедуры позволили для воспроизводимых измерений отдыха и вызвали мышечного кальция переходных, которые были легко поддаются количественной оценке.
Методы в этой работе могут быть использованы для измерения базовых уровней цитосолика кальция и переходных в постсинаптических клеток мышц стенки тела в C. elegans. Приводятся примеры данных, использующих два различных метода иммобилизации. Оба метода воспользоваться оптогенетики деполяризации мышечных клеток без использования электрической стимуляции. Эти примеры демонстрируют осуществимость этого метода при оценке мутаций, которые влияют на постсинаптическую обработку кальция у червей, и указывают на плюсы и минусы двух иммобилизационных подходов.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs являются мощным инструментом в C. elegans нейробиологии. Предыдущая работа использовала методы визуализации кальция для изучения широкого спектра функций в нейронах и мышечных клетках, включая сенсорные и поведенческие реакции, с различными методами стимуляции. Некоторые исслед?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-ра Александра Готтшалька за «X1659», RCaMP и channelrhodopsin, содержащий штамм червей, доктора Hongkyun Кима за штамм червей slo-1 (eg142) и Национальный проект биоресурсов для штамма червя sca-1 (tm5339).
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
Referências
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genética. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
