In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles
Summary
Este método proporciona una manera de acoplar optogenéticas y sensores de calcio codificados genéticamente para crear imágenes de los niveles basales de calcio citosólico y cambios en los transitorios de calcio evocados en los músculos de la pared corporal del organismo modelo C. elegans.
Abstract
El organismo modelo C. elegans proporciona un excelente sistema para realizar imágenes de calcio in vivo. Su cuerpo transparente y su manipulabilidad genética permiten la expresión específica de sensores de calcio codificados genéticamente. Este protocolo describe el uso de estos sensores para la toma de imágenes in vivo de la dinámica de calcio en células objetivo, específicamente los músculos de la pared corporal de los gusanos. Mediante la utilización de la co-expresión de la carredopsina presináptica, la estimulación de la liberación de acetilcolina de las neuronas motoras excitatorias se puede inducir utilizando pulsos de luz azul, lo que resulta en la despolarización muscular y cambios reproducibles en el calcio citoplasmático Niveles. Dos técnicas de inmovilización de gusanos se discuten con diferentes niveles de dificultad. La comparación de estas técnicas demuestra que ambos enfoques preservan la fisiología de la unión neuromuscular y permiten la cuantificación reproducible de los transitorios de calcio. Al combinar la optogenética y las imágenes funcionales de calcio, los cambios en el manejo del calcio postsináptico y la homeostasis se pueden evaluar en una variedad de orígenes mutantes. Los datos presentados validan ambas técnicas de inmovilización y examinan específicamente las funciones de la C. elegans sarco(endo)plasmático DE calcio reticular ATPase y el canal de potasio BK activado por calcio en la regulación del calcio muscular de la pared corporal.
Introduction
Este artículo presenta métodos para la toma de imágenes de calcio in vivo de los músculos de la pared corporal de C. elegans utilizando estimulación neuronal optogenética. El emparejamiento de un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) con luz azul desencadenó la despolarización neuronal y proporciona un sistema para observar claramente los transitorios de calcio postsináptico salidados. Esto evita el uso de estimulación eléctrica, permitiendo un análisis no invasivo de mutantes que afectan a la dinámica de calcio postsináptica.
Los GECI de un solo fluoróforo, como GCaMP, utilizan una sola molécula de proteína fluorescente fusionada al dominio M13 de la quinasa de cadena ligera de miosina en su extremo N-terminal y calmodulina (CaM) en el C-terminus. Tras la unión al calcio, el dominio CaM, que tiene una alta afinidad por el calcio, sufre un cambio conformacional que induce un cambio conformacional posterior en la proteína fluorescente que conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia1. La fluorescencia GCaMP se excita a 488 nm, por lo que no es adecuado para ser utilizado en combinación con la canalrodilina, que tiene una longitud de onda de excitación similar de 473 nm. Por lo tanto, con el fin de acoplar las mediciones de calcio con la estimulación de la canalroditina, la proteína fluorescente verde de GCaMP debe ser reemplazada por una proteína fluorescente roja, mRuby (RCaMP). El uso del músculo rCaMP expresado, en combinación con la expresión de la neurona motora colinérgica de la canalrodiasina, permite estudios en la unión neuromuscular del gusano (NMJ) con el uso simultáneo de la optogenética y la imagen funcional dentro del mismo animal 2.
El uso de la cedrodonina evita la necesidad de la estimulación eléctrica para despolarizar las uniones neuromusculares de C. elegans,lo que sólo se puede lograr en preparaciones diseccionadas, haciendo así esta técnica más fácil de emplear y más precisa cuando se dirige a tejidos específicos. Por ejemplo, channelrhodopsin se ha utilizado previamente en C. elegans para activar de forma reversible neuronas específicas, lo que conduce a la activación robusta de las neuronas excitatorias o inhibitorias3,4. El uso de la despolarización estimulada por la luz también elude el problema del daño neuronal debido a la estimulación eléctrica directa. Esto proporciona una oportunidad para examinar los efectos de muchos protocolos de estimulación diferentes, incluyendo estimulaciones sostenidas y repetidas, en la dinámica de calcio postsináptica4.
La naturaleza transparente de C. elegans lo hace ideal para el análisis funcional de imágenes fluorescentes. Sin embargo, al estimular las neuronas de acetilcolina excitatorias en el NMJ, se espera que los animales respondan con una contracción muscular inmediata4,haciendo que la inmovilización de los gusanos crítico para visualizar cambios discretos de calcio. Tradicionalmente, se han utilizado agentes farmacológicos para paralizar a los animales. Uno de estos fármacos utilizados es levamisol, un agonista del receptor de acetilcolina colinérgico5,6,7. Dado que el levamisol conduce a la activación persistente de un subtipo de receptores musculares excitatorios, este reactivo no es adecuado para el estudio de la dinámica muscular de calcio. La acción del levamisol induce la despolarización postsináptica, elevando el calcio citosólico y ocluiendo observaciones después de la estimulación presináptica. Para evitar el uso de medicamentos paralizantes, examinamos dos métodos alternativos para inmovilizar C. elegans. Los animales fueron pegados y luego diseccionados abiertos para exponer los músculos de la pared del cuerpo, similar al método de electrofisiología C. elegans NMJexistente 8,o nanoperlas se utilizaron para inmovilizar animales intactos9. Ambos procedimientos permitían las mediciones reproducibles del reposo y evocaban transitorios musculares de calcio que eran fácilmente cuantificables.
Los métodos en este artículo se pueden utilizar para medir los niveles basales de calcio citosólico y transitorios en las células musculares de la pared del cuerpo postsináptico en C. elegans. Se proporcionan ejemplos de datos que emplean las dos técnicas de inmovilización diferentes. Ambas técnicas aprovechan la optogenética para despolarizar las células musculares sin el uso de estimulación eléctrica. Estos ejemplos demuestran la viabilidad de este método en la evaluación de mutaciones que afectan el manejo de calcio postsináptico en los gusanos y señalan los pros y los contras de los dos enfoques de inmovilización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las GECIs son una herramienta poderosa en neurobiología de C. elegans. El trabajo anterior ha utilizado técnicas de diagnóstico por imágenes de calcio para examinar una amplia variedad de funciones tanto en las neuronas como en las células musculares, incluidas las respuestas sensoriales y conductuales, con diversos métodos de estimulación. Algunos estudios han utilizado estímulos químicos para desencadenar transitorios de calcio en las neuronas ash sensoriales22,<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Alexander Gottschalk por ZX1659, la RCaMP y la canalización que contiene cepa de gusanos, el Dr. Hongkyun Kim por la cepa de gusano slo-1(eg142) y el Proyecto Nacional de Biorecursos para la cepa de gusanos sca-1(tm5339).
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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