In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo
Summary
Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l’immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell’organismo modello C. elegans.
Abstract
L’organismo modello C. elegans fornisce un ottimo sistema per eseguire l’imaging in vivo del calcio. Il suo corpo trasparente e la sua manipolabilità genetica consentono l’espressione mirata di sensori di calcio geneticamente codificati. Questo protocollo delinea l’uso di questi sensori per l’imaging in vivo della dinamica del calcio nelle cellule mirate, in particolare i muscoli della parete corporea dei vermi. Utilizzando la co-espressione della channelrhodopsin presintica, la stimolazione del rilascio dell’acetilcolina dai motoneuroni eccitatori può essere indotta utilizzando impulsi di luce blu, con conseguente depolarizzazione muscolare e cambiamenti riproducibili nel calcio citoplastico Livelli. Due tecniche di immobilizzazione dei vermi sono discusse con diversi livelli di difficoltà. Il confronto di queste tecniche dimostra che entrambi gli approcci preservano la fisiologia della giunzione neuromuscolare e consentono la quantificazione riproducibile dei transitori di calcio. Associando l’optogenetica e l’imaging funzionale del calcio, i cambiamenti nella manipolazione post-sinaptica del calcio e nell’omeostasi possono essere valutati in una varietà di background mutanti. I dati presentati convalidano entrambe le tecniche di immobilizzazione ed esaminano specificamente i ruoli del c. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase e il canale di potassio BK attivato dal calcio nella regolazione del calcio muscolare della parete corporea.
Introduction
Questo articolo presenta metodi per l’imaging del calcio in vivo dei muscoli della parete corporea di C. elegans utilizzando la stimolazione neuronale optogenetica. L’associazione di un muscolo ha espresso indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) con la depolarizzazione neuronale innescata dalla luce blu e fornisce un sistema per osservare chiaramente i transitori di calcio postsinaptico evocati. Questo evita l’uso della stimolazione elettrica, consentendo un’analisi non invasiva dei mutanti che influenzano la dinamica post-sinaptica del calcio.
I GECI a singolo fluoroforo, come GCaMP, utilizzano una singola molecola proteica fluorescente fusa nel dominio M13 della catena luminosa miosina chinasi all’estremità terminale N e al calmodulin (CaM) al C-terminus. Al momento del legame del calcio, il dominio CaM, che ha un’alta affinità per il calcio, subisce un cambiamento conformazionale che induce un successivo cambiamento conformazionale nella proteina fluorescente che porta ad un aumento dell’intensità fluorescenza1. La fluorescenza GCaMP è eccitata a 488 nm, rendendola inadatta per essere utilizzata in combinazione con la channelrhodopsin, che ha una lunghezza d’onda di eccitazione simile di 473 nm. Pertanto, al fine di accoppiare le misurazioni del calcio con la stimolazione della channelrhodopsin, la proteina fluorescente verde di GCaMP deve essere sostituita con una proteina fluorescente rossa, mRuby (RCaMP). Utilizzando il muscolo espresso RCaMP, in combinazione con l’espressione del neurone motorio colinergico della channelrhodopsin, permette studi presso la giunzione neuromuscolare del verme (NMJ) con l’uso simultaneo di optogenetica e imaging funzionale all’interno dello stesso animale 2.
L’uso della channelrhodopsin bypassa la necessità che la stimolazione elettrica depolarizzi le giunzioni neuromuscolari di C. elegans, che possono essere raggiunte solo in preparati sezionati, rendendo così questa tecnica più facile da impiegare e più precisa quando si prendono di mira tessuti specifici. Ad esempio, la channelrhodopsin è stata precedentemente utilizzata in C. elegans per attivare in modo reversibilizzato neuroni specifici, portando all’attivazione robusta di neuroni eccitatori o inibitori3,4. L’uso della depolarizzazione stimolata dalla luce elude anche il problema dei danni neuronali dovuti alla stimolazione elettrica diretta. Questo offre l’opportunità di esaminare gli effetti di molti protocolli di stimolazione diversi, tra cui stimolazioni sostenute e ripetute, sulla dinamica post-sinaptica del calcio4.
La natura trasparente di C. elegans lo rende ideale per l’analisi funzionale dell’imaging fluorescente. Tuttavia, quando si stimolano i neuroni eccitatori di acetilcolina al NMJ, gli animali sono tenuti a rispondere con una contrazione muscolare immediata4, rendendo l’immobilizzazione dei vermi critici nella visualizzazione dei cambiamenti discreti di calcio. Tradizionalmente, gli agenti farmacologici sono stati utilizzati per paralizzare gli animali. Uno di questi farmaci utilizzati è levamisole, un agonista recettore acetilcolina colinergico5,6,7. Poiché levamisole porta all’attivazione persistente di un sottotipo di recettori muscolari eccitatori, questo reagente non è adatto per lo studio della dinamica del calcio muscolare. L’azione di levamisole induce depolarizzazione post-sinaptica, elevando il calcio citosolico, e osservazioni occlude a seguito di stimolazione pressinaptica. Per evitare l’uso di farmaci paralizzanti, abbiamo esaminato due metodi alternativi per immobilizzare C. elegans. Gli animali sono stati incollati e poi sezionati aperti per esporre i muscoli della parete del corpo, simile al metodo elettrofisiologia C. elegans NMJesistente 8, o nanosfere sono state utilizzate per immobilizzare gli animali intatti9. Entrambe le procedure hanno permesso le misurazioni riproducibili dei transitori di calcio muscolare a riposo ed evocate che erano facilmente quantificabili.
I metodi in questo documento possono essere utilizzati per misurare i livelli di calcio citosolico di base e transitori nelle cellule muscolari post-sinaptiche della parete del corpo in C. elegans. Vengono forniti esempi di dati che utilizzano le due diverse tecniche di immobilizzazione. Entrambe le tecniche sfruttano l’optogenetica per depolarizzare le cellule muscolari senza l’uso di stimolazione elettrica. Questi esempi dimostrano la fattibilità di questo metodo nella valutazione delle mutazioni che influenzano la manipolazione post-sinaptica del calcio nei vermi e sottolineano i pro e i contro dei due approcci di immobilizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
I GECI sono un potente strumento nella neurobiologia di C. elegans. Il lavoro precedente ha utilizzato tecniche di imaging del calcio per esaminare un’ampia varietà di funzioni sia nei neuroni che nelle cellule muscolari, comprese le risposte sensoriali e comportamentali, con vari metodi di stimolazione. Alcuni studi hanno utilizzato stimoli chimici per innescare transitori di calcio nei neuroni sensoriali ASH22,23 o per indurre le onde di calcio nei mu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Alexander Gottschalk per la SX1659, la RCaMP e la channelrhodopsin contenente ceppo di verme, dr. Hongkyun Kim per il ceppo di vermi slo-1(eg142) e il National Bioresource Project per il ceppo di vermi sca-1(tm5339).
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
Referências
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