Exakt avslöjande av metoder och protokoll är avgörande för storskalig användning av stamcellsterapier. Här presenterar vi ett protokoll för att isolera fett-härledda regenerativa celler, som används för en enda intrakavernös injektion som behandling av erektil dysfunktion (ED) efter radikal prostatektomi (RP).
Stamceller används inom många forskningsområden inom regenerativ medicin delvis för att dessa behandlingar kan vara botande snarare än symptomatiska. Stamceller kan erhållas från olika vävnader och flera metoder för isolering har beskrivits. Den presenterade metoden för isolering av fett-härledda regenerativa celler (ADRC) kan användas inom många terapeutiska områden eftersom metoden är ett allmänt förfarande och därför inte begränsat till erektil dysfunktion (ED) terapi. ED är en vanlig och allvarlig biverkning av radikal prostatektomi (RP) eftersom ED ofta inte behandlas väl med konventionell behandling. Att använda ADRC som behandling för ED har väckt stort intresse på grund av de initiala positiva resultaten efter en enda injektion av celler i corpora cavernosum. Metoden som används för isolering av ADRC är en enkel, automatiserad process som är reproducerbar och säkerställer en enhetlig produkt. Dessutom säkerställs steriliteten hos den isolerade produkten eftersom hela processen sker i ett slutet system. Det är viktigt att minimera risken för kontaminering och infektion eftersom stamcellerna används för injektion hos människor. Hela proceduren kan göras inom 2,5-3,5 timmar och kräver inte ett klassificerat laboratorium som eliminerar behovet av att skicka vävnad till en off-site. Förfarandet har emellertid vissa begränsningar eftersom den minsta mängden dränerat lipoaspirat för att isoleringsanordningen ska fungera är 100 g.
Stamceller har förmågan att differentiera sig till olika celltyper, och de utsöndrar parakrina faktorer som tros främja läkningsprocessen i skadad vävnad 1,2,3,4. De är därför attraktiva inom regenerativ medicin, eftersom de kan representera en möjlig botande behandling.
Radikal prostatektomi (RP) är den gyllene botande behandlingen för patienter med låg / mellanliggande risk lokaliserad prostatacancer och en förväntad livslängd > 10 år. Syftet med operationen är att utrota cancern, men den har flera biverkningar. Förekomsten av postprostatektomiinkontinens varierar från 2-60% och erektil dysfunktion (ED) upplevs av 20-90% av patienterna5. Nervsparande teknik är ett alternativ hos vissa patienter (Gleason-poäng < 7, låg risk för extrakapsulär sjukdom)5. Denna teknik skonar nerverna som är ansvariga för erektion, men även om detta är möjligt rapporterar många patienter fortfarande ED postoperativt.
Behandlingsalternativ för penisrehabilitering efter RP består främst av behandling med PDE-5-hämmare, injektions- eller instillationsterapi och vakuumpumpar. Läkemedel som används för penisrehabilitering skiljer sig farmakologiskt, men deras verkningsmekanism innefattar avslappning av glattmuskelcellerna i corpus cavernosum. Många patienter upplever dock behandlingssvikt och uppnår aldrig en effekt av läkemedlet som möjliggör samlag6.
ED som inträffar efter RP tros bero på strukturellt irreversibla förändringar7. Dessa förändringar sker i den kavernösa vävnaden och inkluderar apoptos av glattmuskel- och endotelceller och fibros. Den veno-ocklusiva mekanismen som är ansvarig för en central del av erektionen, försämras av förändringarna, vilket resulterar i sämre fyllning och hårdhet i penis7.
Många av patienterna rapporterar att ED de upplever har en negativ inverkan på deras livskvalitet8. De är inte redo att ge upp sin sexuella aktivitet efter operationen och därför är en botande terapi för ED attraktiv när de andra tillgängliga behandlingarna för penisrehabilitering misslyckas.
I tidigare studier, inklusive djur- och små fas 1-studier på människor, har stamceller visat lovande resultat som en alternativ behandling för ED 2,9,10,11,12. Resultaten visar att det är säkert att använda ADRC, och att erektilfunktionen förbättras avsevärt efter en enda injektion i corpora cavernosum 2,9,10,11,12. Fett-härledda regenerativa celler (ADRC) tros stödja vävnadsregenerering genom parakrin mekanismer genom befrielse av flera hormoner, neurotrofiska och andra tillväxtfaktorer, cytokiner och eventuellt mikro-RNA13. Dessutom kan ADRC differentieras till flera mogna celltyper inklusive endotel- och vaskulära muskelceller, broskceller, osteocyter och neuroner14,15. Dessa egenskaper gör stamceller intressanta för att utveckla en permanent ny behandling för ED.
Stamceller är uppdelade i flera grupper, i princip de som härrör från det tidiga embryot (embryonala stamceller) och de från vuxen vävnad (vuxna stamceller). Vuxna stamceller inkluderar mesenkymala stamceller (MSC) som är multipotenta och finns i benmärgen, fettvävnaden, navelsträngsblodet, moderkakan och tandmassa17.
Stamceller från fettvävnaden är lätta att få tillgång till, till skillnad från stamceller som härrör från benmärg. Att skörda stamceller från benmärgen är ett riskabelt och smärtsamt förfarande jämfört med fettsugning. Antalet celler som är möjliga att skörda från benmärgen kommer att begränsas, medan endast patientens depåer av fettvävnad sätter gränsen för antalet celler som kan skördas. Det är därför möjligt att isolera en stor mängd stamceller från fettvävnaden utan att efterföljande behöva odla cellerna för att erhålla en tillfredsställande mängd. De fett-härledda regenerativa cellerna, även ofta kallade stroma vaskulära fraktionen (SFV), består av många celltyper inklusive MSC, endotelceller, pericyter, immunceller och förfäder härav18. Dessa kan alla spela en roll i den regenerativa processen.
Syftet med föreliggande studie är att undersöka effekten av stamceller på ED efter RP genom att använda 4 ml autologa ADRC isolerade från nyskördad fettvävnad efter injektion i corpora cavernosum.
Det presenterade förfarandet för isolering av ADRC är inte begränsat till att endast användas för ED-terapi, men kan användas i flera andra former av behandling och experiment. Vår studie visade att autologa, nyligen isolerade ADRC är säkra att använda, och behandlingen är väl tolerabel i en 12 månaders uppföljning.
Innan förfarandet används finns det några överväganden att göra. En nackdel med denna procedur är att patienten måste vara under generell anestesi under fettsugningen. Fettsugning är möjlig att utföra under lokalbedövning, men en tidigare studie har visat att en kombination av lokalbedövningsmedel och adrenalin kan ha en negativ inverkan på celltillväxten av fibroblaster20. Risken att bli under generell anestesi är generellt låg, men ett negativt resultat ses fortfarande. Denna risk måste beaktas när patienter väljs ut för behandlingen. Fettsugning är ett kirurgiskt ingrepp och kommer därför alltid att medföra risk för komplikationer. Som med alla andra kirurgiska ingrepp finns det risk för postoperativ blödning som resulterar i bildning av hematom och risk för infektion. Några av våra patienter rapporterade också en övergående minskad känslighet i bukhuden. En omedelbar komplikation till fettsugning är blödning. Det är känt att patienter riskerar att få systemiska komplikationer när stora mängder vävnad tas bort. Fettsugningen i denna procedur var relativt liten och ansågs därför inte vara en riskfaktor.
Komplikationer vid injektion av celler rapporteras som övergående rodnad, ömhet och hematom.
Enheten som används för isolering av ADRC: erna valdes eftersom systemet är CE-godkänt. I Danmark är det obligatoriskt att använda CE-godkänd utrustning eftersom myndigheterna kategoriserar behandling med stamceller som en drogtestprövning, när ADRC används för injektion på människor.
Enheten har fördelar som att hela proceduren standardiseras och utförs i en sluten steril miljö utan att kräva ett högt klassificerat laboratorium. Risken för kontaminering minskar därför. Detta säkerställer att förfarandet är enhetligt och reproducerbart och att slutproduktens kvalitet alltid är densamma varje gång (det beror dock också på kvaliteten på den ingående vävnaden). Att utföra isoleringen på enheten är enkelt och kräver inte specialutbildade operatörer.
En begränsning av enheten är att minsta ingång i maskinen är 100 g dränerat lipoaspirat. Eftersom fettsugningen är helt klar innan cellbearbetningen börjar (och i vårt fall på en annan plats, inte i OR) enligt vår erfarenhet, kommer detta att kräva att mängden lipoaspirat är minst 125 ml med det grova måttet på 50 ml sprutorna. Annars finns det risk för att det inte finns tillräckligt med material för maskinen att gå vidare med. Att använda den övre ändgränsen (max ingång är 425 ml) skulle också resultera i en mycket lång isoleringsprocedur.
Vuxna stamceller från både fettvävnad och benmärg verkar ha kapacitet för självförnyelse och differentiering som embryonala stamceller. En av fördelarna med ADRC jämfört med hemopoietiska stamceller är ett 100-500 gånger högre utbyte per vävnadsvolym jämfört med benmärg21,22, och därför behöver ADRC inte odlas. Dessutom är hemopoietiska stamceller svårare och mer smärtsamma att skörda från patienten än fettvävnad. I många situationer är fettvävnad bara en avfallsprodukt efter operationen. Det är möjligt att odla stamceller för att ge ett högre utbyte som är lämpligt för angiogenes, men nyisolerade ADRC kan ha högre angiogen potential än odlade23.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har grundats av Odense Universitetssjukhus (11/31936), Danskt Centrum för Regenerativ Medicin (14/50427) och Danska Cancerfonden.
Liposuction | |||
Abdominal Binder | Dale | Size depent of the patient | |
Adhessive OP-towel | Mölnlycke Health Care | 906677 | 90×75 cm |
Adrenalin 1 mg/ml | Amgros I/s | 74 44 23 | 1 ml |
Basic OP supplies | Mölnlycke Health Care | 97010873-07 | |
Carbon Steel blade 11 | Swann-Morton | ||
Chlorhixidine Ethanol | Faarborg Pharma | 5% colored | |
Disposable set Lipocollector 3 | Human Med | 670200 | |
Extension hoses | Extrudan | 5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M long | |
Gaze Rags | Barrier | 175201 | 30×45 cm |
Jelonet | Smith and Nephew Medical Ltd | 90509225 | 10 x 10 cm |
Marcaine 5 mg/ml + Adrenaline 5 micrigram | Astra Zeneca | 20 mL | |
Mesorb Bandage | Mölnlycke Health Care | 677001 | 10×13 cm |
Microlance | Becton Dickinson | 304622 | 18 G + 23 G |
Monocryl suture | Ethicon | 04:00 | |
Ringer-lactat | Fresinus Kabi | ||
Sterile gloves | Gammex | 330052065 | |
Surgical Gown | Mölnlycke Health Care | 690103-01 | |
Surgical Marker | Richard-Allan | ||
Surgical Mask | 3M | ||
Syringe | Codan Medical | 6,28,402 | 50/60 ml cath tip |
Syringe | Becton Dickinson | 700016181 | 1 ml |
WAL- Applikator for cannulae 25/30 cm | Human Med | REF 500001 | |
Isolation of ADRC's | |||
1 ml Syringe | Becton Dickinson | REF 303172 | |
3 way stopcock | One Med | REF 10554-01 | |
Adhesive OP-towel | Mölnlycke Health Care AB | REF 906677 | 90×75 cm |
Cytori Celution 800IV device | Cytori | ||
Desinfection swaps | Mediq Danmark | 3340010 | |
Microlance | Becton Dickinson | 25G (0,5*25 mm) | |
Nitril Gloves | Abena | Powder free | |
OR drape Sheet, 2 layers | Lohmann & Rauscher | REF 33005 | |
Ringers Lactate | Fresinus Kabi | 06756 (DK) | |
Sterile gloves | |||
Sterile gown | |||
Supplemental kit for Cytori Celution 800IV devise | Cytori | ||
Termometer | Thomas Scientific | traceable | |
Injection of ADRC's | |||
Aperture drape | One Med | REF1565-01 | 75*90 cm |
Desinfection swap | Mediq Danmark | 3340010 | |
Pean | Leibinger | 32-01257 | |
Silicone Vessel Loop | Purple Surgical | REF PS3203 | |
Sterile gloves | Sempermed | Or Use your favorite |