Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann > 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.
Abstract
Die Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die jedem menschlichen Gens regulieren zu identifizieren, ist eine schwierige Aufgabe, die erfordert zahlreiche experimentelle und rechnerische Ansätze zu integrieren. Eine solche Methode ist die Hefe ein-Hybrid (Y1H) Assay, in welche, die Wechselwirkungen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter-Gene getestet werden. Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als “DNA-Köder” (z.B.., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine “TF-Beute,” die auf Reporter Genaktivierung untersucht werden kann. Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H-Bildschirme basieren auf TF-Beute Bibliotheken oder Arrays in DNA-Köder Hefestämme zu verwandeln. Hier beschreiben wir eine Pipeline, verbesserte Y1H genannt (eY1H) Tests, wo TF-DNA-Wechselwirkungen verhört werden, bei der Paarung DNA-Köder-Stämme mit einer angeordneten Sammlung von TF-Beute Stämme mit einem high-Density-Array (HDA) Roboter-Plattform, mit der Vorführung in einem 1.536 Kolonie-Format. Dies ermöglicht eine drastische Zunahme der Durchsatz (60 DNA-Köder-Sequenzen gegen > 1.000 TFs dauert zwei Wochen pro Forscher) und Reproduzierbarkeit. Wir illustrieren die verschiedenen Arten von erwarteten Ergebnissen von Tests menschlichen Promotorsequenzen gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs, sowie Beispiele für Probleme, die während der Bildschirme und wie man sie beheben können.
Introduction
Ein zentrales Problem im Bereich Biomedizin ist die Mechanismen Bestimmung jedes menschliche gen geregelt. Transkription ist der erste Schritt bei der Kontrolle der gen-Expression-Ebenen, und es wird durch Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die einzigartig für jedes Gen reguliert. Angesichts der Tatsache, dass Menschen für kodieren > 1.500 TFs1,2, Ermittlung des vollständigen Satzes von TFs, die der Tätigkeit des einzelnen Gens Steuern bleibt eine offene Herausforderung.
Zwei Arten von Methoden können verwendet werden, um TF-DNA-Wechselwirkungen Karte: TF-zentriert und DNA-zentrierten Methoden3 (Abbildung 1A). In TF-zentrierten Methoden ist eine TF von Interesse für die Bindung genomische DNA-Regionen oder seine DNA-Bindung Spezifität zu ermitteln sondiert. Diese Methoden umfassen Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung, Protein Bindung Microarrays und SELEX4,5,6. In DNA-zentrierten Methoden ist eine DNA-Sequenz des Interesses sondiert, um den Satz von TFs zu bestimmen, die an der DNA-Sequenz binden. Die am häufigsten angewandte solcher Methoden ist Hefe One-Hybrid (Y1H) Tests, in denen, die Interaktionen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter Gene7,8,9getestet werden.
Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als “DNA-Köder” (z.B., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine “TF-Beute,” die Reporter-Gen Aktivierung9,10 (Abbildung 1 b) gezeigt werden kann. Der DNA-Köder wird geklont, stromaufwärts von zwei Reporter Gene (LacZ und HIS3) und beide DNA-bait::reporter-Konstrukte sind integriert Hefegenoms generieren chromatinized “DNA-Köder Stämme.” Die TF-Beute, codiert in ein Plasmid, das einen TF verschmolzen mit der Aktivierungsdomäne (AD) der Hefe Gal4 TF ausdrückt wird in die DNA-Köder Sorte Fisch für TF-DNA-Wechselwirkungen eingeführt. Wenn die TF-Beute an die DNA-Köder-Sequenz bindet, wird die Anzeige in der TF-Beute vorhanden zur Aktivierung der beiden Reporter-Gene führen. Infolgedessen, können Zellen mit einem positiven Interaktion für Wachstum auf Tellern Histidin fehlt, als auch als kompetitiver Inhibitor, 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT) die Überwindung ausgewählt und als blauen Kolonien im Beisein von X-gal visualisiert werden. Weil die potente Hefe Gal4 AD dient, Y1H Assays können Interaktionen mit transcriptional Aktivatoren sowie Repressoren erkennen. Darüber hinaus angesichts der Tatsache, dass TF-Beute aus einem starken Hefe-Promotor (ADH1) ausgedrückt werden, können Wechselwirkungen auch für TFs erkannt werden, die geringe endogene Expression Ebenen, die herausfordern, um von ChIP11,12zu erkennen.
Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H Assays basieren auf DNA-Köder Hefestämme TF-Beute einzuführen, durch die Umwandlung von gepoolter TF-Beute-Bibliotheken, gefolgt von Auswahl, Kolonie, die Kommissionierung und Sequenzierung den interagierenden TF identifizieren, oder durch Umwandlung einzelner klont8,9. Dies sind zeitraubende Protokolle, Beschränkung der Anzahl von DNA-Sequenzen, die pro Forscher getestet werden können. Eine jüngste Verbesserung der Y1H-Assays, genannt verstärkt Y1H (eY1H), die Screening-Durchsatz mit einer high-Density Arrays (HDA) Roboterplattform Hefestämme DNA-Köder mit einer Sammlung von Hefestämme jeweils mit dem Ausdruck einer anderen Paaren sprunghaft angestiegen TF-Beute10,13 (Abbildung 1). Diese Bildschirme beschäftigen ein 1.536 Kolonie Format erlaubt, die meisten menschlichen TFs in vervierfacht mit nur drei Platten zu testen. Weiter, angesichts der Tatsache, dass TF-DNA-Wechselwirkungen in gewissem Sinne paarweise getestet werden, ermöglicht dieser Ansatz für den Vergleich von Interaktionen zwischen DNA-Köder (z. B. zwei forensisches Einzel-Nukleotid-Varianten) und zwischen verschiedenen TFs oder TF Varianten11,12 ,14.
Mit eY1H-Assays, haben wir den größten menschlichen und Caenorhabditis Elegans DNA-zentrierten TF-DNA-Wechselwirkungen Netzwerke bis dato abgegrenzt. Insbesondere haben wir 2.230 Interaktionen zwischen 246 menschlichen Entwicklungs-Enhancer und 283 TFs12gekennzeichnet. Darüber hinaus haben wir eY1H Assays aufzudecken veränderten TF Bindung an 109 Einzel-Nukleotid forensisches Varianten zugeordnet Erbkrankheiten wie Entwicklungsstörungen Fehlbildungen, Krebs und neurologische Erkrankungen eingesetzt. Vor kurzem haben wir eY1H ein Netzwerk bestehend aus 21.714 Interaktionen zwischen 2.576 C. Elegans gen Promotoren und 366 TFs11abzugrenzen. Dieses Netzwerk wurde die funktionale Rolle der Dutzende von C. Elegans TFs aufzudecken.
Die Protokolle zum DNA-Köder Flecken zu generieren und die Ebenen der Reporter Hintergrundaktivitäten zu bewerten gewesen berichtet an anderer Stelle15,16,17. Hier beschreiben wir eine eY1H-Pipeline, die verwendet werden kann, menschlichen genomische DNA-Region gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs auf den Bildschirm. Sobald eine Hefe DNA-Köder Belastung entsteht und eine TF-Beute-Array wird auf die entsprechenden Platten entdeckt, kann das gesamte Protokoll innerhalb von zwei Wochen (Tabelle 1) durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, kann das Protokoll parallelisiert werden, so dass ein einzelner Forscher 60 DNA-Köder-Sequenzen gleichzeitig Bildschirm kann. Um das Protokoll zu demonstrieren, haben wir die Veranstalter der beiden Zytokin-Gene CCL15 und IL17F überprüft. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse aus gescheiterten Bildschirme zu veranschaulichen die Arten von Problemen, die auftreten können, bei der eY1H-Assays und wie sie zu beheben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier beschriebene stark Roboter eY1H Paarung Screening Ansatz erhöht den Durchsatz um den Satz von TFs zu identifizieren, die an eine DNA-Region, im Vergleich zu früheren Bibliothek Screening oder angeordneten Screening Ansätze beruhen auf Umwandlung zu binden. Weiter, die TF-DNA-Wechselwirkungen von eY1H, die Tests sehr reproduzierbar sind, da 90 % der Interaktionen erkannt sind positiv für alle vier Kolonien pro TF getestet, und 90 % der Interaktionen testen in einem unabhängigen Bildschirm des gleichen Hefe D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [R35-GM128625, J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
Referências
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