Intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus til Tumor immun profilering og behandling svar vurdering

Summary

Her præsenterer vi en reproducerbar metode til at udvikle en orthotopic murine model af hoved og hals planocellulært karcinom. Tumorer påvise klinisk relevante histopatologiske funktioner af sygdom, herunder nekrose, dårlig differentiering, nodal metastaser og immun infiltration. Tumor-bærende mus udvikler klinisk relevante symptomer herunder dysfagi, kæben forskydning og vægttab.

Abstract

Hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) er en invaliderende og dødbringende sygdom med høj prævalens af gentagelse og behandling fiasko. For at udvikle bedre terapeutiske strategier, forståelse tumor microenvironmental faktorer, der bidrager til behandling modstanden er vigtig. En større hindring for forståelse sygdomsmekanismer og forbedre terapi har været en mangel på murine cellelinjer, der ligner den aggressive og metastatisk karakter af menneskelig HNSCCs. Derudover beskæftiger et flertal af murine modeller subkutane implantations af tumorer, der mangler vigtige fysiologiske funktioner af hoved og hals region, herunder høj kar densitet, omfattende lymfe vaskulatur og bosiddende slimhinde flora. Formålet med denne undersøgelse er at udvikle og beskrive en orthotopic model af HNSCC. Vi anvender to genetisk forskellige murine cellelinjer og etablerede tumorer i buccale slimhinden i mus. Vi optimere collagenase-baserede tumor fordøjelsen metoder til optimal genopretning af enkelt celler fra etablerede tumorer. De data præsenteres her viser, at mus udvikler meget vaskulariserede tumorer, der metastaserer til regionale lymfeknuder. Encellede multiparametric masse flowcytometri analyse viser tilstedeværelsen af forskellige immun befolkningsgrupper med myeloide celler der repræsenterer størstedelen af alle immunceller. Den model, der foreslås i denne undersøgelse har applikationer i kræft biologi, tumor immunologi og prækliniske udvikling af nye lægemidler. Ligheden af orthotopic modellen til kliniske tegn på sygdom hos mennesker vil være et redskab for øget oversættelse og bedre patienternes resultater.

Introduction

HNSCC er den femte mest almindelige malignitet globalt, med over 600.000 patienter diagnosticeres årligt¹. Trods aggressiv behandling med kemoterapi og strålebehandling (RT), forbliver den samlede overlevelse (OS) satsen for HNSCC patienter uden humant papillomvirus (HPV) infektion under 50% efter 5 år². Dette er i vid udstrækning tilskrives en yderst komplekse tumor mikromiljø som tumorer kan stamme fra flere forskellige anatomiske steder i regionen hoved og hals, herunder buccale slimhinde, tungen, gulvet i munden, næsehulen, mundhulen, svælg, oropharynx og hypopharynx. Derudover regionen hoved og hals er meget vaskulariserede og indeholder næsten halvdelen af alle lymfeknuder i kroppen³. Et flertal af studier undersøger hoved og hals tumor biology stole på tumor modeller i regionen flanke. Sådanne modeller kan tilbyde indsigt i tumor-iboende mekanismer, men manglen på den indfødte hoved og hals mikromiljø kan betydeligt påvirke translationel potentialet i sådanne resultater. En metode, der er blevet brugt til at fremkalde mundtlige tumorer er gennem eksponering for kræftfremkaldende 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA)⁴. Dog, denne metode er forbundet med en langvarig proces, fremkalder tumorer hos rotter og hamstere men ikke i mus, og de resulterende tumorer ikke besidder mange af de histologiske funktioner af differentierede SCCs^5,6. Indførelsen af carcinogen4-nitroquinoline 1-oxid (4-NQO), et vandopløseligt quinolon derivat, resulterede i mus mundtlige tumorer når de anvendes oralt, men også lidt fra lange eksponeringstider (16 uger) og en begrænset tage sats inden for og mellem partier mus^7,8,9. For at udvikle klinisk relevante modeller, udnyttede flere grupper gensplejsede modeller der involverer manipulation af driver onkogener eller tumor suppressor gener, herunder TP53, TGFB, KRAS, HRAS og SMAD4¹⁰. Disse modeller kan tilbyde indsigt i tumorer med kendte driver gener men sammenfatte ikke de komplekse heterogenitet af menneskelige HNSCCs.

I dette arbejde demonstrere vi muligheden for at udføre en intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus. Podede cellerne udvikle sig til aggressive tumorer senest 1 uge efter injektion. Svarende til menneskets HNSCCs, tumorer metastaserer til de regionale lymfeknuder. Vi karakteriserer histologiske og kliniske funktioner af sygdommen og give indsigt i tumor immun mikromiljø. Vi foreslår, at denne orthotopic model af HNSCC har applikationer i kræft biologi, tumor immunologi og prækliniske undersøgelser. Mekanismer af immun unddragelse, tumor progression, behandling modstand og metastaser repræsenterer områder af klinisk betydning, der kan adresseres ved hjælp af den foreslåede model.

Protocol

Alle dyr procedurer blev udført i overensstemmelse med en godkendt institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) protokol af University of Colorado Denver (protokol # 00250). 1. tumor cellekultur Bemærk: B4B8 og LY2 cellelinjer blev brugt til at generere orthotopic HNSCC tumorer: B4B8 tumorceller blev afledt fra kræftfremkaldende-omdannet slimhinde keratinocytter (fra BALB/C mus)11. LY2 tumorceller blev afledt fra lymfek…

Representative Results

In vitro-vurdering af LY2 og B4B8 celleproliferation viste, at begge cellelinjer har lignende fordobling gange (21 og 23 h, henholdsvis). In vivo, begge cellelinjer dannede en enkelt, synlig og håndgribelig masse senest 1 uge efter podning (figur 1A). I mus forsynet med LY2 tumorer, blev kæben fordrevet af 3 uger på grund af tumor byrde (figur 1A). Control mus, der ikke modtog tumorceller udvikler ikke tumorer som forventet. L…

Discussion

Grundig analyse og karakterisering af tumor mikromiljø repræsenterer en vigtig strategi for forståelse mekanismer af tumor udvikling, progression og metastaser og udvikling af effektive behandlinger. Hoved og hals kræft er en kompliceret sygdom, der kan stamme fra flere anatomiske steder inden for regionen hoved og hals. En større hindring for forståelse sygdomsmekanismer og forbedre terapi har været en mangel på murine mus cellelinjer, der ligner den aggressive og metastatisk karakter af menneskelig HNSCCs. Desu…

Materials

Collagenase III	Worthington Biochemical Corp.	LS004183
DNase I	Worthington Biochemical Corp.	LS006328
Fc Block (CD16/32)	BD Biosciences	553141	Clone 2.4G2
Flow Cytometry Staining Buffer	eBioscience	00-4222-26
HBSS	ThermoFisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no pheno red
Helois mass cytometer	Fluidigm	NA
Matrigel membrane matrix	Corning	CB-40234B
MRI Scanner	Bruker	NA	7.4 Tesla
RBC lysis buffer	BioLegend	420301
Trypsin inhibitor	Worthington Biochemical Corp.	LS002830