Apresentamos uma técnica citogenética simples usando ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar a taxa de fertilização e principal razão sexual do haplodiploid invasiva Praga Bemisia tabaci.
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Artigo de método
Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética
Neste artigo
Resumo
Resumo
Umas poucas espécies de sugadores de seiva whiteflies são algumas das mais danosas pragas terrestres em todo o mundo devido o que eles causem danos à lavoura e vírus de planta que eles vector. Apesar de numerosos estudos da biologia destas espécies em diferentes ambientes, um parâmetro chave história de vida, relações de sexo de prole, tem recebido pouca atenção, no entanto, é importante para prever a dinâmica populacional. A proporção sexual primária (proporção sexual em oviposição) de Bemisia tabaci nunca foi relatada, mas podem ser encontrada, determinando a taxa de fertilização do ovo deste insecto haplodiploid. A técnica envolve a dechorionation de ovos com água sanitária, uma série de etapas de fixação e a aplicação da geral DNA fluorescente mancha, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, um corante fluorescente de DNA-ligando), para ligar a pró-núcleos masculinos e femininos. Aqui, apresentamos a técnica e um exemplo de sua aplicação, para testar se uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenciado a proporção sexual primária de b. tabaci. Esse método pode auxiliar nos estudos de população da whiteflies, ou para determinar se a alocação de sexo existe com certos estímulos ambientais.
Introdução
O estudo da alocação de sexo, ou o investimento relativo em prole masculina e feminina, é uma pedra angular da ecologia comportamental1,2,3. Além de seu poder para testar modelos adaptáveis de comportamento, saber que a estratégia de alocação de sexo de um organismo pode melhorar modelos de sua dinâmica populacional. Em muitas espécies, alocação de sexo é controlada por mães. Para determinar a alocação de sexo, é importante determinar a proporção sexual primária ou a proporção de fêmeas no momento da deposição do ovo. Embora a proporção sexual na emergência de adultos pode fo....
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Protocolo
Nota: Certifique-se de que todo o trabalho é realizado à temperatura ambiente em uma área bem ventilada ou sob uma coifa. Todos os 'gotas' neste protocolo são definidas como 5 – 20 µ l, dependendo da preferência do operador.
1. configuração inicial
- Permita whiteflies femininos ovipositar em folhas limpas. Gaiolas de clip ou folhas cortadas para caber no ágar em um prato de Petri são exemplos de arenas de oviposição. Faça um buraco coberto na gaiola de clip ou capa de Petri para inserir e remover os adultos. Alternativamente, rapidamente colocou um vaso de adultos coletados no gelo e, em seguida, depositá-los na fo....
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Resultados
Para testar se Rickettsia afeta a taxa de fertilização das fêmeas de MEAM1 de b. tabaci , nós criados Rickettsia-infectado (R.+) ou não infectados (R.–) b. tabaci em plantas de feijão-caupi (Vigna unguiculata) em separar as gaiolas em 27 ° C, umidade relativa de 70% e um fotoperíodo escuro h luz/8 de 16 h. R+ e R– 4º ínstar whiteflies foram cuidadosamente retirados das folhas e isolados em tubos de ti.......
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Discussão
Este protocolo é o primeiro a capturar a taxa de fertilização ou primária proporção sexual de b. tabaci. O desafio do presente protocolo é que ele requer pesquisadores aprender a lidar com os ovos da mosca branca rapidamente, garantindo que não mais de 1h se passou desde que os ovos foram oviposited até que eles são fixos. Durante experimentos preliminares, os ovos que foram corrigidos em 3h ou mais postoviposition eram muito velhos para observar a fecundação, como syngamy tinha ocorrido e divisões mitóticas est.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de NSF (DEB-1020460) para M.S.H. e um subsídio de USDA AFRI (2010-03752) para M.S.H. Os autores graças a Brennan Zehr para coloração de ovos de mosca branca com muita habilidade e Zen. Os autores agradecer a Mike Riehle permitindo o uso de seu microscópio fluorescente para a imagem latente. Os autores agradecer Suzanne Kelly e Marco Gebiola as imagens de ovo. Os autores Obrigado Suzanne Kelly e Jimmy Conway para ajudar nos momentos cruciais durante os experimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Qualquer | ||
| 1x TBST | Qualquer | solução 5x feita de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 e 1,0 g de NaN3 pH 7,5, e levada a 1 L com água de grau PCR | |
| Alvejante | Clorox | Qualquer alvejante doméstico funcionará desde que possa ser diluído a 0,83% Hipoclorito de sódio | |
| Esmalte transparente | Qualquer | ||
| DAPI dilactato | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Etanol | Qualquer | diluir a 70% EtOH | |
| Microscópio fluorescente | Nikon | Nikon Eclipse 50i foi usado neste experimento, mas qualquer microscópio fluorescente com filtro de excitação de 340/380 nm e ampliação de pelo menos 4-10x pode ser usado | |
| Ácido acético glacial | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glicerol | Qualquer | ||
| microscópio | selvagem | Um microscópio Wild M5A foi usado para este experimento, mas qualquer microscópio onde o operador possa ver claramente os ovos da mosca-branca pode ser usado | |
| Tampas de lâminas de microscópio | Quaisquer | métodos são para tampas de lâminas de 18 mm x 18 mm. Mais mídia de montagem precisará ser adicionada para tampas deslizantes maiores. | |
| Lâminas de microscópio | Qualquer | ||
| pino nadel Minuten | BioQuip | 1208SA | Os pinos nadel Minuten são opcionais para modelagem como sondas com pontas de pipeta |
| NaCl | Qualquer | ||
| NaN3 | Qualquer | ||
| n-propil-galato | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Pipetas Bemis | ||
| Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Pipetas Pasteur de vidro borossilicato descartáveis 5.75 in. Um bico de Bunsen também pode ser necessário se o operador quiser alongar e estreitar pipetas |
| de grau PCR | Qualquer | ||
| Ponteiras de pipeta | Quaisquer | pontas de pipeta são opcionais para modelagem como sondas com pinos nadel minúsculos | |
| Bulbo conta-gotas pequeno | Qualquer | Deve caber na pipeta Pasteur | |
| Tris | Qualquer | ||
| Tween-20 | Qualquer |
Referências
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R.
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Reimpressões e permissões
