Bestemme Egg befruktning Rate av Bemisia tabaci med en Cytogenetic teknikk
Summary
Vi presenterer en enkel cytogenetic teknikk bruker 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) å avgjøre befruktning hastigheten og primære sex forholdet haplodiploid invasiv pest Bemisia tabaci.
Abstract
A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Til tross for mange studier av biologi av disse artene i ulike miljøer, en nøkkel livshistorie parameter, avkom sex prosenter, har fått lite oppmerksomhet, men er viktig for å forutsi populasjonsdynamikk. Primære sex ratio (sex ratio på oviposition) av Bemisia tabaci har aldri blitt rapportere, men det finnes ved å bestemme egg befruktning frekvensen av denne haplodiploid insekt. Teknikken innebærer dechorionation egg med blekemiddel, en rekke fiksering trinn og påføring av de generelle DNA fluorescerende flekken, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, en DNA-bindende fluorescerende farge), binde til kvinnelige og mannlige pronuclei. Her presenterer vi teknikken, og et eksempel av anvendelsen, å teste om en endosymbiotic bakterie, Rickettsia sp. nr. bellii, påvirket primære sex forholdet mellom B. tabaci. Denne metoden kan hjelpe i befolkningsstudier av whiteflies, eller å finne ut om sex tildeling finnes med visse miljømessige stimuli.
Introduction
Studiet av sex tildeling eller relativ investeringen i mannlige og kvinnelige avkom, er en hjørnestein i atferdsdata økologi1,2,3. I tillegg til sin makt for å teste adaptive modeller av atferd, kan vite sex allokering strategi en organisme forbedre modeller av sin populasjonsdynamikk. I mange arter kontrolleres sex tildeling av mødre. For å avgjøre sex tildeling, er det viktig å bestemme primære sex ratio eller andelen kvinner ved egg deponering. Selv om sex ratio på voksen fremveksten kan gi hint til sex tildeling, kan differensial utviklingsmessige dødelighet mellom mannlige og kvinnelige yngel vanligvis skew voksen sex ratio vesentlig. Hos noen arter Hymenoptera, rekkefølgen av insekter inneholder ants, bier og veps, er primære sex ratio fastslått med cytogenetic analyser, farging embryo for å vise genetisk DNA. Fordi hymenopterans er haplodiploid, et begynnende mannlige egg er haploid og inneholder bare den kvinnelige pronucleus (n), mens begynnende kvinnelig egg er diploide og inneholder både mannlige og kvinnelige pronuclei (2n). Selv om Aleyrodidae, sap-fôring familien sann bugs (Nebbmunner) kjent som whiteflies, er også haplodiploid, har det ikke vært etablert analysen til å finne primære sex ratio i disse insekter. Dette er kanskje overraskende gitt intensiteten i studiet av noen kosmopolitiske alvorlige skadedyr i denne familien og betydningen av sex prosenter i konkurransedyktige interaksjoner whiteflies4,5,6,7 ,8,9,10 og populasjonsdynamikk generelt. I haplodiploid insekter også, er sex ratio ubegrenset av sex besluttsomhet systemer, slik at muligheten for selektiv befruktning og labil sex forholdstall som varierer med miljø2. Her presenterer vi en teknikk for å bestemme primære sex ratio av arter kompleks av whiteflies kollektivt kjent som sweetpotato whitefly, B. tabaci. Dette en Artsnavnet omfatter mer enn 28 arter verdensomspennende11og inkluderer noen av de mest ødeleggende globale invasiv skadedyr12,13. Bruk av denne teknikken å avgjøre sex tildeling mønstre i B. tabaci og andre Aleyrodidae vil gi en mer grundig undersøkelse av variabler, inkludert temperatur, verten anlegget, endosymbiotic bakterier eller anlegg/whitefly patogener, som kan påvirke whitefly primære sex forholdstall og whitefly populasjonsdynamikk.
Vi er klar over noen sammenlignbar egg flekker teknikker for B. tabaci. Protokollen er praktisk med flekker metodene som brukes for andre insekt-egg14 som den utelater en overnatting fiksering trinn, og derfor kan fullføres innen 3 h. Som et eksempel på et program, en endosymbiotic bakterie, Rickettsia sp. nr. bellii, er assosiert med kvinnelig skjevhet i våre laboratorier linjer B. tabaci Midtøsten-Asia Minor 1 (MEAM1)15,16. I en B. tabaci MEAM1 laboratorium linje (“MAC1,” samlet fra Maricopa Agricultural Center), vi teste om Rickettsia-infiserte (R+) kvinner gjødsle mer egg enn infisert (R–) kvinner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er først til å fange befruktning satsen eller primære sex forholdet mellom B. tabaci. Utfordringen med denne protokollen er at det krever forskere å lære å håndtere whitefly egg raskt, sikre at ikke mer enn 1 h har gått siden eggene ble oviposited til de er fast. Under innledende eksperimenter var egg som ble løst på 3t eller flere postoviposition for gammel til å observere befruktning, som syngamy hadde skjedd og mitotisk divisjoner ble igangsatt. Mellom 1 til 3 h tok pronuclei en a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av en NSF stipend (DEB-1020460) til M.S.H. og USDA AFRI stipend (2010-03752) til M.S.H. Forfatterne takker Brennan Zehr til farging whitefly egg med mye dyktighet og Zen. Forfatterne takker Mike Riehle for tillater bruk av hans fluorescerende mikroskop for bildebehandling. Forfatterne takker Suzanne Kelly og Marco Gebiola for egg bilder. Forfatterne takker Suzanne Kelly og Jimmy Conway for å hjelpe på avgjørende øyeblikk under forsøkene.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
Referências
- Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
