Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

Summary

Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.

Abstract

A importância das culturas in vitro de 3D é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos. No entanto, a falta de reprodutibilidade experimental é uma das suas restrições. Produzir alguns resultados reproduzíveis de formação padrão deteriora-se a análise dos mecanismos subjacentes a auto-organização. Reduzir a variação em condições de cultura inicial, tais como a densidade celular e distribuição na matriz extracelular (ECM), é crucial para melhorar a repetibilidade de uma cultura 3D. Neste artigo, vamos demonstrar um procedimento simples mas eficiente para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter formações padrão altamente repetitivo. Um micromold com uma forma desejada foi fabricado usando fotolitos ou um processo de usinagem, e formou-se um bolso 3D em ECM contido em um cubo de gel de híbrido (HGC). Células altamente concentradas então foram injetadas no bolso, para que a forma de aglomerado celular combinado com a forma do molde fabricado. O trabalhador assalariado HGC permitido multi-direcional digitalização por sua rotação, o que permitiu a geração de imagens de alta resolução e captura a todo da estrutura do tecido mesmo que utilizou-se uma lente de ampliação baixa. Normais células epiteliais brônquicas humanas foram usadas para demonstrar a metodologia.

Introduction

A importância de uma cultura 3D, que melhor imita ambientes biológicos do que uma cultura 2D, é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos^1,2,3. A interação entre as células e matriz extracelular (ECM) fornece pistas importantes sobre a morfogênese^4,5. Muitas formações de tecido podem surgir apenas em ambientes 3D, como o dobramento processo^6,7, invaginação⁸e formação tubular^9,

Protocol

1. fabricação de dispositivo de cubo híbrido gel

1. Prepare um quadro cúbicos de policarbonato (PC) usando um processo de usinagem ou uma impressora 3D. O tamanho da moldura PC varia de acordo com o tamanho da amostra. Neste estudo, usamos uma moldura de 5 mm de cada lado para que os ramos tinham espaço suficiente para alongar durante o cultivo.
2. Coloque o quadro de PC sobre uma lâmina de vidro previamente resfriado ou outra superfície lisa em uma caixa de gelo (< 0 ° C) (figura 1A).
3. Adicione 12 µ l de pré-aquecido agarose 1,5% (p/v) da face superior do quadro cúbico para a superfície de fundo com uma pipeta. Aca....

Results

Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar a metodologia ilustrada e controlar a geometria inicial célula coletiva para alcançar uma forma do cilindro e uma forma de prisma, respectivamente, em um ambiente de ECM. São apresentados os resultados de imagem multi-direcional obtidos por contraste de fase, bem como a faloidina coloração de uma forma de cilindro (Figura 4AB) e a forma de prisma (

Discussion

O método apresentado neste trabalho é simples e pode ser realizado sem equipamentos de alta tecnologia. Simultaneamente, pode ser obtido um resultado do controle precisos célula aglomerado forma no espaço 3D de hidrogel. Após o controle inicial, as células podem crescer na HGC tanto quanto eles são cultivados em um prato. A imagem multi direcional é executada girando-se a amostra com o HGC usando qualquer sistema de microscopia e melhora significativamente a qualidade de imagem. A escolha dos materiais para o frame HGC e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 12 poços	Corning  Inc.	3513
Acetato de 2-Metoxi-1-metiletila	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% de paraformaldeído	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, baixa temperatura de gelificação  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM kit de bala	Lonza	CC-3170	Meio especializado para células NHBE
Solução de albumina de soro bovino (10%)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 kit de bala	Lonza	CC-3162	Meio especializado para células endoteliais
Lipidure	NOF co.		Polímero MPC
Matrigel fator de crescimento reduzido matriz de membrana basal	Corning  Inc.	354230
Soro de cabra normal (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Células epiteliais brônquicas humanas normais	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W / C	Dow Corning Co.	3255981	Resina base e catalisador para PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Fotorresistente negativo espesso (espessura: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416