Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Summary

Nós apresentamos abordagens experimentais para estudar RNA-interactianos de double-stranded RNA ligação proteína quinase RNA-ativado (PKR) durante o ciclo de pilha mamífero usando células HeLa. Este método utiliza o formaldeído para complexos de crosslink RNA-PKR e imunoprecipitação para enriquecer RNAs ligados a PKR. Estes RNAs podem ser analisados ainda mais através de sequenciamento de alto rendimento ou qRT-PCR.

Abstract

Proteína quinase RNA-ativado (PKR) é um membro das proteínas de resposta imune inata e reconhece a estrutura secundária de double-stranded do RNA viral. Quando vinculado a viral double-stranded RNA (dsRNAs), o PKR sofre de dimerização e autofosforilação subsequente. PKR fosforilada (pPKR) torna-se ativo e induz a fosforilação de subunidade alfa do fator de iniciação eucariótico 2 (eIF2α) para suprimir a tradução global. Aumentando a evidência sugere que a PKR pode ser ativada em condições fisiológicas, tais como durante o ciclo celular ou sob diferentes condições de estresse, sem infecção. No entanto, nosso entendimento sobre os ativadores de RNA de PKR é limitado devido à falta de um método experimental padronizado para capturar e analisar dsRNAs PKR-interagindo. Aqui, apresentamos um experimental protocolo especificamente enriquecer e analisar PKR limite RNAs durante o ciclo celular utilizando células HeLa. Nós utilizamos a atividade de reticulação eficiente de formaldeído para corrigir complexos PKR-RNA e isolá-los através da imunoprecipitação. Então, PKR co-immunoprecipitated RNAs podem ser processados para gerar uma biblioteca de sequenciamento de alto rendimento ainda mais. Uma classe importante de PKR-interagindo celular dsRNAs é RNAs mitocondriais (mtRNAs), que podem existir como intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre os RNAs de luz-fio e pesados-strand. Para estudar o strandedness destes mtRNAs frente e verso, apresentamos também um protocolo para a vertente específica qRT-PCR. Nosso protocolo é otimizado para a análise de RNAs PKR-limite, mas ele pode ser facilmente modificado para estudar dsRNAs celular ou RNA-interactianos de outras proteínas com ligação dsRNA.

Introduction

Proteína quinase RNA-ativado (PKR), também conhecido como eucarióticas iniciação fator alfa-2 da quinase 2 (EIF2AK2), é uma bem caracterizadas proteína quinase que transmite informações fornecidas por RNAs. Pertence a alfa de subunidade de iniciação 2 Tradução eucariota (eIF2α) família quinase e fosforila eIF2α em serina 51 em resposta à infecção para suprimir a tradução global¹. Neste contexto, o PKR é ativado por RNAs virais double-stranded (dsRNAs), que fornecem uma plataforma para PKR dimerização e autofosforilação². Além de eIF2α, PKR pode também phosphorylate p53, substrato do receptor de insulina 1, inibidor κB e ....

Protocol

1. solução e célula preparação

1. Preparação da solução
   1. Para o meio de cultura celular, prepare-se meio para cultura de células HeLa, adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) para 500 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM).
      Nota: Os antibióticos podem ser adicionados ao meio de cultura celular, mas não usamos antibióticos.
   2. Para o 0,1% paraformaldeído, dissolver paraformaldeído 4% (p/v) em 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) com aquecimento em uma chapa quente e diluir para fazer 30 mL de 0,1% (v/v) paraformaldeído adicionando 1X PBS.
      Atenção: Executar todas as etapas em uma coifa e tenha cuidado para não ferver a solução de ....

Results

Um esquema para o processo de prender HeLa células em fase S ou M do ciclo celular é mostrado na Figura 1. Para uma amostra da fase-preso M, podemos Visualizar claramente redondo em forma de células sob o microscópio (Figura 2A). Para examinar a eficácia da detenção do ciclo celular, o conteúdo nuclear da célula pode ser analisado usando FACS (Figura 2B). A Figura 3 mostra dados representativos para teste de eficiência de.......

Discussion

O processo para preparar amostras de fase-preso S ou M é ilustrado na Figura 1. Para prender as células na fase S, usamos um método de bloqueio duplo de timidina onde tratamos as células com timidina duas vezes com um lançamento de 9h entre elas para assegurar a prisão de alta eficiência (figura 1A). Para a detenção de fase M, tratamos as células uma vez com timidina seguido por um lançamento de 9 h e então aplicado nocodazole ao bloco de células em prometafase .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	AM9260G
1 M Tris, pH 7,0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
1 M Tris, pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
tubo de microcentrífuga de 1,7 mL	Axygen	MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)	Biosolution	BN015
Tampão de carregamento de DNA 10X	TaKaRa	9157
15 mL tubo cônico	SPL	50015
3' adaptador			5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3
M Acetato de Sódio pH 5.5	Thermo Fisher Scientific	AM9740
5' adaptador			5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl	Thermo Fisher Scientific	AM9760G
Tubo cônico de 50 mL	SPL	50050
Ácido-fenol clorofórmio, pH 4.5	Thermo Fisher Scientific	AM9722
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Grânulos magnéticos DNA/RNA limpam
fosfatase alcalina antártica	New England Biolabs	M0289S
Anti-DGCR8			Fabricado em casa
Anti-PKR (D7F7)	Tecnologia de sinalização celular	12297S
Anti-PKR (Milli)	Millipore EMD	07-151
ATP (100 mM)	GE Healthcare	GE27-2056-01
Sal de sódio azul de bromofenol	Sigma-aldrich	B5525
Fosfatase	alcalina intestinal de bezerroTaKaRa	2250A
Raspador de células 25 cm 2 posições	Sarstedt	83.183
		promotora CMV	5'-CGCAAATGGGCGGTAGGGTG-3'Dulbecco's
modificado meio de águia Welgene		LM001-05
mistura dNTP (2,5 mM)	TaKaRa	4030
Etanol, Absoluto, Grau ACS	Alfa-Aesar	A9951
Soro fetal bovino	Merck	M-TMS-013-BKR
Formamida	Merck	104008
Glicina	Bio-basic	GB0235
Coprecipitante GlycoBlue (15 mg / mL)	Thermo Fisher Scientific	AM9516
Isopropanol	Merck	8.18766.1000
NEB Kit de depleção de rRNA	Kit de Depleção de rRNA	New England Biolabs	E6318
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404
de sinalização de células	IgG de coelho normal	2729S
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	6148
PCR forward primer (RP1)			5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
Índice de PCR primer reverso (RPI)			5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'Tubos
PCR com tampa plana, 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
Comprimido de solução salina bufered fosfato (PBS)	TaKaRa	T9181
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0530	Polimerase
de alta fidelidadeMicrocentrífuga PlateFuge com rotor basculante	Benchmark	c2000
Polinucleotídeo quinase (PNK)	TaKaRa	2021A
Proteinase K, recombinante, PCR Grau	Sigma-Aldrich	3115879001
qPCR sequência de primer: CO1 Pesado			Frente/Reverso: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CO1 Light			Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CO2 Pesado			Frente/Reverso: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CO2 Light			Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CO3 Pesado			Frente/Reverso: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CO3 Light			Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CYTB Pesado			para frente / para trás: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: CYTB Light			Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: GAPDH			Direto/Reverso: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND1 Pesado			Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND1 Light			Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND4 Pesado			Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND4 Light			Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND5 Pesado			Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND5 Light			Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND6 Pesado			Frente/Reverso: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Sequência de primer qPCR: ND6 Light			Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Hexâmero aleatório	Thermo Fisher Scientific	SO142
Dnase Recombinante I (Rnase-free) (5 U/μ L)	TaKaRa	2270A
Inibidor de Rnase recombinante (40 U/μ L)	TaKaRa	2313A
Kit de Remoção de rRNA Ribo-Zero Kit de Remoção de rRNA	Illumina	MRZH116
Rotador	FINEPCR, ROTATOR AG	D1.5-32
RT sequência de primers: CO1 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
Sequência de primer RT: CO1 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
Sequência de primer RT: CO2 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
Sequência de primer RT: CO2 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
Sequência de primer RT: CO3 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
Sequência de primer RT: CO3 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
Sequência de primer RT: CYTB Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
Sequência de primer RT: CYTB Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
Sequência de primer RT: GAPDH			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
Sequência de primer RT: ND1 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAAGGGTGGAGAGG-3′
Sequência de primer RT: ND1 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
Sequência de primer RT: ND4 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
Sequência de primer RT: ND4 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
Sequência de primer RT: ND5 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
Sequência de primer RT: ND5 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
Sequência de primer RT: ND6 Heavy			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
Sequência de primer RT: ND6 Light			5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Polipropileno siliconizado 1,5 mL G-tubo	Bio Plas	4167SLS50
Dedecil sulfato de sódio	Biosesang	S1010
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D6750
SUPERase In Rnase inibidor	Thermo Fisher Scientific	AM2694
SuperScript III transcriptase reversa	Thermo Fisher Scientific	18080093	Transcriptase reversa para preparação de biblioteca
SuperScript IV transcriptase reversa	Thermo Fisher Scientific	18090010	Transcriptase reversa para qRT-PCR
SYBR ouro ácido nucleico gl stain	Thermo Fisher Scientific	S11494
T4 polinucleotídeo quinase	New England Biolabs	M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)	New England Biolabs	M0204
T4 RNA ligase 2, truncado KQ	New England Biolabs	M0373
Thermomixer	Eppendorf ThermoMixer C com ThermoTop
Timidina	Sigma-Aldrich	T9250
Tris-borato-EDTA tampão (TBE)	TaKara	T9122
Triton X-100	Promega	H5142
Ultralink Grânulos de sepharose de proteína A	Thermo Fisher Scientific	22810	Grânulos de proteína A
Ultrasonicator	Bioruptor
Ureia	Bio-basic	UB0148
Misturador de vórtice	DAIHAN Scientific	VM-10
Xileno cianol	Sigma-Aldrich	X4126
γ-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3,3 μ M)	PerkinElmer	BLU502A100UC