Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

Summary

Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.

Abstract

O uso de vírus recombinantes tornou-se crucial em virologia básica ou aplicada. Genética reversa tem sido provada para ser uma tecnologia extremamente poderosa, tanto para decifrar os mecanismos de replicação viral e para estudar antivirais ou fornecer a plataforma de desenvolvimento de vacinas. A construção e manipulação de um sistema de genética reversa para um negativo-vertente vírus RNA como um vírus sincicial respiratório (VSR), no entanto, continua a ser delicados e requer conhecimentos especiais. O genoma da RSV é um single-strand, negativo-sentido RNA de cerca de 15 kb, o que serve como um modelo para replicação do RNA viral e transcrição. Nosso sistema de genética reversa utiliza uma cópia de cDNA do genoma humano de longa estirpe de RSV (HRSV). Este cDNA, bem como a codificação de proteínas virais do complexo da polimerase de cDNAs (L, P, N e M2-1), são colocados em vetores de expressão individual sob sequências de controle do polymerase T7. O transfection desses elementos nas células de BSR-T7/5, que expressam estàvel polymerase T7, permite a replicação citoplasmática e transcrição de recombinação RSV, dando origem a virions geneticamente modificados. Uma nova RSV, que está presente na superfície da célula e no sobrenadante de cultura de BSRT7/5, está reunida para infectar células humanas de HEp-2 para amplificação viral. Duas ou três rodadas de amplificação são necessárias para obter ações virais contendo 1 x 10⁶ a 1 x 10⁷ unidades formadoras de placa (PFU) / mL. Métodos para o ideal da colheita, congelamento e titulação de estoques virais são descritos aqui em detalhes. Ilustramos o protocolo aqui apresentado, criando dois vírus recombinantes expressando respectivamente livre proteína verde fluorescente (GFP) (RSV-GFP) ou viral M2-1 fundida a GFP (RSV-M2-1-GFP). Mostramos como usar RSV-GFP para quantificar a replicação RSV e a RSV-M2-1-GFP para visualizar estruturas virais, bem como a dinâmica da proteína viral em células vivas, usando técnicas de vídeo microscopia.

Introduction

RSV humana é a principal causa de hospitalização por infecção aguda do trato respiratório em crianças em todo o mundo¹. Além disso, a RSV é associado com um fardo de doença substancial em adultos comparáveis à gripe, com a maioria da hospitalização e carga de mortalidade no idoso². Não existem vacinas ou específicas antivirais disponíveis ainda contra RSV, mas prometendo novas drogas estão em desenvolvimento^3,4. A complexidade e o peso das técnicas de quantificação de multiplicação RSV impedem a busca de antivirais ou vacinas, apesar dos esforços consideráveis atuais. A quantificação de multiplicação RSV in vitro geralmente é baseada em métodos trabalhosos, demorados e caros, que consistem principalmente na análise do efeito citopático por microscopia, imunocoloração, redução de placa bacteriana, ensaios, quantitativos transcriptase reversa (qRT)-reação em cadeia da polimerase (PCR) e testes de ensaio enzima-lig da imunoabsorção. Vírus com genomas modificadas e expressar genes repórter, tais como aqueles que codifica para o GFP, são mais adequados para tais projeções. Juntamente com a utilização de leitores de placa automatizado, vírus recombinantes gene portadores de repórter podem fazer estes ensaios mais adequados para fins de padronização e alta produtividade.

RSV é um vírus de RNA sentido negativo envelopado, conjuntos que pertence ao gênero Orthopneumovirus do Pneumoviridae familiar, ordem Mononegavirales⁵. O genoma da RSV é um single-strand, negativo-sentido RNA de cerca de 15 kb, que contém uma região não-codificante as extremidades 3′ e 5′ chamado Leader e Trailer e 10 unidades transcricionais codificação 11 proteínas. Os genes estão ordenados da seguinte forma: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codificação para proteínas M2-1 e M2-2) e L-5′. O RNA genômico é firmemente embalado pela cadeia s. Using o RNA genômico encapsidated como um modelo, viral RNA-dependente do RNA polimerase (RdRp) garantirá a transcrição e replicação do RNA viral. RdRp viral é composto da proteína grande L que exerce a atividade de polimerase nucleotídeo por si, seu cofator obrigatório o phosphoprotein P e a proteína M2-1, que funciona como uma transcrição viral fator⁶. Em células infectadas, RSV induz a formação de inclusões citoplasmáticas, chamado de corpos de inclusão (IBs). Inclusões citoplasmáticas morfologicamente semelhantes têm sido observadas por várias Mononegavirales^7,8,9,10. Estudos recentes sobre o vírus da raiva, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus Ebola e RSV mostrou que a síntese de RNA viral ocorre na IBs, que assim podem ser consideradas como fábricas viral^{8,9,11, 12}. as fábricas de vírus concentrar o RNA e as proteínas virais necessárias para a síntese de RNA viral e também contêm proteínas celulares^{13,14,15,16, 17}. SII exibem um subcompartment funcional chamado grânulos de IB-associado (IBAGs), que concentram o recém synthetized nascente mRNA viral juntamente com a proteína M2-1. O genoma RNA e a L, P e N não são detectadas em IBAGs. IBAGs são pequenas estruturas esféricas dinâmicas dentro IBs que exibem as propriedades do líquido organelas¹². Apesar do papel central da IBs na multiplicação viral, muito pouco é conhecido sobre a natureza, estrutura interna, formação e operação destas fábricas viral.

A expressão do genoma de um vírus de um cDNA permitiu a produção do primeiro clone infeccioso viral em 1981¹⁸. Para single-stranded vírus de RNA negativos, não foi até 1994 que a produção de um vírus de raiva primeira seguindo transfection de plasmídeos em células¹⁹ teve lugar. O primeiro baseado em plasmídeo reverso sistema genético para RSV foi publicado em 1995,²⁰. Genética reversa têm levado a grandes avanços no campo da virologia. A possibilidade de introduzir modificações específicas no genoma viral forneceu insights críticos sobre a replicação e a patogênese dos vírus de RNA. Esta tecnologia também muito tem facilitado o desenvolvimento de vacinas permitindo atenuação específica através de uma série específica de modificações. Modificações de genoma, permitindo uma rápida quantificação de multiplicação viral grandemente melhoraram a triagem antiviral e estudo do seu modo de ação.

Embora anteriormente descrito, obter RSVs geneticamente modificados continua a ser delicado. Aqui, detalhamos um protocolo para criar dois tipos de HRSV recombinante, respectivamente, expressando RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Neste protocolo, descrevemos as condições de transfeccao necessárias para resgatar os novos vírus recombinantes, bem como sua amplificação para obter ações virais com título elevado, apropriado para experimentações reprodutíveis. A construção de vetores a genética reversa por si não está descrita aqui. Descrevemos os métodos de colheita ideal e congelamento de estoques virais. O método mais preciso para quantificar as partículas virais infecciosas permanece o ensaio da chapa. Células são infectadas com diluições em série da suspensão analisada e incubadas com uma sobreposição que proíbe a difusão de partículas virais livres no sobrenadante. Em tais condições, o vírus só irá infectar células contíguas, formando uma “placa” para cada partícula infecciosa inicial. No ensaio de titulação convencional de RSV, placas são reveladas por imunocoloração e contadas sob observação microscópica. Este método é caro e demorado. Aqui descrevemos um protocolo muito simples para um ensaio de placa RSV usando sobreposição de celulose microcristalina que permite a formação de placas visíveis a olho nu. Mostramos como RSV-GFP pode ser usado para replicação de RSV medida e, assim, para quantificar o impacto de antivirais. Combinação genética reversa e tecnologia de imagem ao vivo, demonstramos como RSV-M2-1-GFP permite aos cientistas para visualizar M2-1 em células vivas e a seguir a dinâmica das estruturas virais intracelulares, tais como IBs.

Protocol

1. material preparação Compra de mídia de célula (soro reduzida mídia, mínimo essencial [MEM], 10 x MEM e Dulbecco modificada do meio da águia [DMEM]), reagente de transfeccao e celulose microcristalina (ver Tabela de materiais). Obter os seguintes vetores para genética reversa: o vector(s) genômica e os vetores de expressão de codificação da proteína N e as proteínas complexas de polimerase. Os genômicos vetores contêm o genoma completo do cDNA da RSV-GFP (p-RSV-GFP) …

Representative Results

Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para produzir recombinantes vírus RSV, expressando uma proteína fluorescente (Figura 2). Em pRSV-GFP, o gene GFP foi introduzido entre os genes P e M, conforme descrito para o gene cereja em trabalho anteriormente publicado21. No pRSV-M2-1-GFP, o gene M2 foi deixado intocado e um adicional gene que codifica para M2-1-GFP foi inserido entre os genes SH e G12. A…

Discussion

Aqui nós apresentamos um método de resgate de recombinante RSVs de cinco plasmídeos e sua amplificação. A capacidade de manipular o genoma do vírus tem revolucionado a pesquisa de virologia para testar as mutações e expressar um gene adicional ou uma proteína viral marcada. A RSV temos descrito e usado como exemplo neste artigo é um vírus que está expressando um gene repórter, o RSV-GFP (não publicado) e expressa uma proteína M2-1 fundida a uma marca GFP¹². Resgate de RSV é desafia…

Materials

35mm µ dish for live cell imaging	Ibidi	81156
A549	ATCC	ATCC CCL-185
Avicel RC-591	FMC BioPolymer	Avicel RC-591	Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5		not commercially available	See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution	Sigma	HT90132
Fluorescence microscope for observations	Olympus	IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT	ThermoFisher Scientific	11668019	Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Plasmids		not commercially available	see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker	VWR	444-0341
Si RNA GAPDH	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05	SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005	SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N	Dharmacon	ON-TARGETplus custom siRNA	UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT	Dharmacon	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent	Dharmacon	DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03	Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	ThermoFisher Scientific	25080094
Spectrofluorometer	Tecan	Tecan infinite M200PRO