चूहे में Hyaoid जहाजों का आकलन और विशेषता
Summary
यह प्रोटोकॉल विवो और पूर्व विवो विधियों दोनों में पूरी तरह से कल्पना और hyaloid वाहिकाओं की विशेषता के लिए वर्णन करता है, माउस आंखों में संवहनी प्रतिगमन का एक मॉडल, ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी और फंडस फ्लोरेसीइन एंजियोग्राफी का उपयोग कर लाइव इमेजिंग और पूर्व vivo के लिए मात्रात्मक विश्लेषण के लिए hyaoid के अलगाव और बाद में फ्लैट माउंट.
Abstract
आंख में, भ्रूण hyaloid वाहिकाओं विकासशील लेंस और रेटिना पोषण और पीछे हटना जब रेटिना वाहिकाओं का विकास. hyaoid वाहिकाओं के लगातार या असफल प्रतिगमन लगातार hyperplastic प्राथमिक vitreous (PHPV) जैसे रोगों में देखा जा सकता है, एक बाधित प्रकाश पथ और बिगड़ा दृश्य समारोह के लिए अग्रणी. hyaoid पोत प्रतिगमन अंतर्निहित तंत्र को समझना संवहनी प्रतिगमन प्रक्रिया और संभावित नए तरीके लगातार hyaloid वाहिकाओं के साथ रोगों का प्रबंधन करने के लिए नए आणविक अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यहाँ हम ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) और fundus fluorcein एंजियोग्राफी (FFA) और अलग और फ्लैट-माउंटिंग hyaloid ex vivo के लिए मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत तकनीकी प्रोटोकॉल के साथ लाइव चूहों में इमेजिंग hyaoid के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर से संबंधित प्रोटीन 5 (LRP5) नॉकआउट चूहों लगातार hyaloid वाहिकाओं के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया, तकनीक वर्णन करने के लिए. एक साथ, इन तकनीकों संवहनी प्रतिगमन के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में hyaloid वाहिकाओं की एक पूरी तरह से मूल्यांकन की सुविधा हो सकती है और लगातार hyaloid वाहिकाओं के तंत्र पर अध्ययन.
Introduction
आंख में रक्त की आपूर्ति रेटिना और आसपास के नेत्र ऊतकों के सामान्य विकास को सुनिश्चित करने और एक उचित दृश्य समारोह से लैस करने के लिए आवश्यक है। आंखों में तीन संवहनी बिस्तर हैं: रेटिना वाहिकाविन्यास, कोरॉइड, और hyaoid वाहिकाओं के एक क्षणिक भ्रूण संचार नेटवर्क. नेत्र वाहिका विन्यास के विकास के लिए भ्रूणजनन और ऊतक परिपक्वता में स्थानिक और लौकिक समन्वय की आवश्यकता होती है। तीन संवहनी बिस्तरों में, hyaoid vascualture नवगठित भ्रूण लेंस और विकासशील रेटिना के लिए पोषण और ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए पहली कार्यात्मक रक्त आपूर्ति प्रणाली है। Hyaloid वाहिकाओं एक ही समय में पीछे हटना है कि रेटिना vasculatures विकसित और परिपक्व1. hyaoid vascualture के प्रतिगमन दृश्य समारोह के विकास के लिए एक स्पष्ट दृश्य मार्ग की अनुमति देने के लिए निर्णायक है; इसलिए, इस संवहनी प्रतिगमन प्रक्रिया रेटिना vasculature के विकास के रूप में के रूप में महत्वपूर्ण है. बिगड़ा हुआ hyaloid प्रतिगमन नेत्र रोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, hyaoid वाहिकाओं के प्रतिगमन सेलुलर और आणविक संवहनी प्रतिगमन के विनियमन में शामिल तंत्र की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली प्रदान करता है, जो अन्य अंगों में angiogenic विनियमन के लिए प्रभाव हो सकता है के रूप में अच्छी तरह से.
hyaoid vasculature, hyaoid धमनी (एचए) से व्युत्पन्न, वासा hyaloidea propria (वीएचपी), tunica vasculosa lentis (TVL), और pupillary झिल्ली (पीएम) से बना है. यह भ्रूणीय विकास2के दौरान विकासशील रेटिना, प्राथमिक काचाभ और लेंस को पोषण प्रदान करता है। एचए से उत्पन्न, विहिप की शाखाएं लेंस के लिए काच के माध्यम से पूर्ववर्ती रूप से। TVL लेंस कैप्सूल के पीछे की सतह कप, और प्रधानमंत्री को anastomoses, जो पूर्वकाल पक्ष्माभी धमनियों को जोड़ता है, लेंस के पूर्वकाल की सतह को कवर2,3,प्रधानमंत्री में जहाजों के एक नेटवर्क के गठन में जिसके परिणामस्वरूप 3 , 4 , 5. दिलचस्प बात यह है कि hyaloid vasculature में कोई नसों रहे हैं, और प्रणाली शिरापरक जल निकासी को पूरा करने के लिए choroidal नसों का उपयोग करता है.
मानव भ्रूण में, गर्भकेश के लगभग नौवें सप्ताह में हयालॉयड वाहिकाललकाण्ड लगभग पूरा हो जाता है और जब प्रथम रेटिना वाहिकाओं में दिखाई देते हैं, तो गर्भावधि2के चौथे महीने के दौरान वे पीछे हटने लगते हैं। विहिप के शोष के साथ शुरू, TVL, प्रधानमंत्री के केशिका नेटवर्क के प्रतिगमन, और अंत में, हा बाद में होता है2,3. इस बीच, प्राथमिक काचालु और माध्यमिक काचा भोंच बनाने के लिए शुरू होता है, कोलेजन फाइबर सहित extracellular मैट्रिक्स घटकों से बना. गर्भ के छठे महीने तक, प्राथमिक काच एक छोटी पारदर्शी नहर के लिए प्रकाशिक्त तंत्रिका डिस्क से लेंस तक विस्तार करने के लिए कम हो जाता है, क्लोकेट नहर या hyaoid नहर कहा जाता है, और माध्यमिक vitreous पीछे खंड का मुख्य घटक बन जाता है २ , 3. जन्मसेठीक 3 सप्ताह पहले ही हयालॉयड परिसंचरण अधिकतर 35 से 36 सप्ताह के गर्भ में गायब हो जाता है .
मनुष्यों के विपरीत, जिसमें hyaoid vascualture जन्म के समय पूरी तरह से प्रतिगामी है, माउस hyaloid संवहनी प्रणाली जन्म के बाद पीछे हटना शुरू होता है. चूंकि माउस रेटिना का जन्म एक संवहनी और रेटिना वाहिकाओं के बाद होता है, hyaloid वाहिकाओं प्रसव के बाद के दिन से समवर्ती प्रतिगामी (पी) 4 और ज्यादातर पूरी तरह से P216 द्वारा पीछे हट रहे हैं (चित्र 1) . प्रधानमंत्री P10 और P12 के बीच पहले गायब हो जाता है, और विहिप P12 और P16 के बीच गायब हो जाता है, जबकि TVL और हा कोशिकाओं की एक छोटी संख्या P16 पर भी रहते हैं, और P21 द्वारा hyaoid संवहनी प्रणाली प्रतिगमन लगभग पूरा हो गया है6. इस बीच, रेटिना वाहिका जन्म के बाद विकसित होने लगती है। संवहनी जाल की सतही परत पूरी तरह से P7-P8 पर परिधीय रेटिना तक फैली हुई है, गहरी परत (बाहरी plexiform परत में स्थित) P7-P12 से विकसित होती है, और अंत में, आंतरिक plexiform परत में मध्यवर्ती जाल P12 और P15 7 के बीच विकसित होता है . के रूप में रेटिना vascualture विकसित करता है, यह धीरे-धीरे सहवर्ती hyaoid वाहिकाओं के समारोह की जगह, विकासशील आंख को पोषण और ऑक्सीजन प्रदान. चूहों में hyaoid पोत प्रतिगमन के प्रसव के बाद की घटना का निरीक्षण और hyaloid vascualture का अध्ययन करने के लिए एक आसानी से सुलभ प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है, साथ ही आणविक आधार दोनों शारीरिक और के तहत संवहनी प्रतिगमन प्रक्रियाओं को नियंत्रित रोग की स्थिति8|
hyaloid प्रतिगमन की विफलता PHPV जैसे रोगों में देखा जा सकता है, जो भ्रूण के एक असफल या अधूरा प्रतिगमन के परिणामस्वरूप आंख की एक दुर्लभ जन्मजात विकासात्मक विसंगति है, प्राथमिक काचाभ और hyaloid vasculature9. hyaloid vasculature के प्रतिगमन प्रक्रिया को विनियमित तंत्र जटिल हैं और मोटे तौर पर अध्ययन किया. Hyaloid वाहिकाओं के सामान्य प्रतिगमन के लिए आवश्यक एक प्रमुख आणविक मार्ग Wnt संकेतन मार्ग10है , के रूप में इस मार्ग में आनुवंशिक उत्परिवर्तन दोनों Wnt ligand और रिसेप्टर्स को प्रभावित करने के रूप में मानव में PHPV के साथ जोड़ा गया है9. प्रायोगिक अध्ययनों में एक Wnt ligand, Wnt7b, जो इस प्रतिगमन प्रक्रिया मध्यस्थता करने के लिए विकासशील आँख में hyaloid जहाजों के आसपास मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित है की पहचान की. Wnt7b रिसेप्टर्स frizzled4 के साथ बाध्यकारी द्वारा Wnt संकेतन को सक्रिय करता है (एफजेडडी4) / LRP5 आसन्न endothelial कोशिकाओं में सेल apoptosis आरंभ करने के लिए, hyaloid वाहिकाओं के प्रतिगमन के लिए अग्रणी10. एक परिणाम के रूप में, Wnt7bकमी चूहों hyaoid वाहिकाओं10की दृढ़ता दिखा. इसी प्रकार, एक गैर-परंपरागत वंट लिगंड, नॉरिन (एनडीपी जीन द्वारा एनकोड किया गया), विकास के दौरान हयालॉयड पोत प्रतिगमन को प्रेरित करने के लिए एफजेडडी4/एलआरपी 5 को भी बांधता है। Ndpy/-, Lrp5-/-, और Fzd4/- चूहों सभी प्रदर्शन स्थगित hyaoid पोत प्रतिगमन, Wnt संकेत11,12की एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका का समर्थन, 13,14,15,16. इसके अलावा, एक और Wnt coceptor LRP6 अपने समारोह में LRP5 के साथ ओवरलैप hyaoid संवहनी endothelial कोशिकाओं में Wnt संकेतन मार्ग नियमन पर17. अन्य कारकों है कि भी hyaloid प्रतिगमन में योगदान कर सकते हैं hypoxia-प्रेरक कारक18,19,संवहनी endothelial विकास कारक20,21, कोलेजन-1822शामिल हैं, 23, आर्फ24, एंजियोपोइटिन-225, और हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन-426. इस पेपर में, हम लगातार hyaoid वाहिकाओं के एक मॉडल के रूप में Lrp5-/- चूहों का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन और दोनों vivo और पूर्व vivo तरीकों में दोनों के माध्यम से hyaoid vascualture की विशेषता की तकनीक का प्रदर्शन.
विवो और पूर्व विवो में hyaoid vascualture के दृश्य hyaloid पोत प्रतिगमन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है. Hyaoid vasculature निरीक्षण करने के लिए वर्तमान तरीकों मुख्य रूप से VISUALizing और विहिप और हा का विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित, OCT और एफएफए छवियों के माध्यम से, आंख पार वर्गों, और hyaoid फ्लैट माउंट. OCT और FFA vivo इमेजिंग उपकरण में शक्तिशाली हैं, जीवित जानवरों में अनुदैर्घ्य अवलोकन की अनुमति के बाद वे अपनी आँखें खोल दिया है. इसके अलावा, अलग hyaloid फ्लैट माउंट पूरे hyaloid vascualture के दृश्य प्रदान करता है और पोत संख्या का एक सटीक परिमाण प्राप्त करने के लिए एक साधन. फिर भी हयालॉयड जहाजों की नाजुक और नाजुक प्रकृति और इसके अलगाव के परिणामस्वरूप तकनीकी कठिनाइयों ने नेत्र अनुसंधान में इसके उपयोग को कुछ हद तक10,17,27तक सीमित कर दिया है . इस पत्र में, हम hyaoid वाहिकाओं के दृश्य का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, दोनों में vivo लाइव रेटिना इमेजिंग और पूर्व vivo अलग hyaloid फ्लैट माउंट के संयोजन के लिए इन तकनीकों की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए. इस प्रोटोकॉल को लाइव फंडस और ओसीटी इमेजिंग28 की इन विवो विधि और पृथक hyaloid फ्लैट माउंट11के पूर्व विवो विधि पर पिछले प्रकाशनों से संशोधन और विस्तार के साथ अनुकूलित किया गया है .
Protocol
Representative Results
Discussion
तकनीक का आकलन करने और hyaoid वाहिकाओं की विशेषता के लिए पशु मॉडल में hyaoid पोत प्रतिगमन का निरीक्षण करने के लिए सहज और आवश्यक प्रक्रियाओं रहे हैं, विकास के दौरान संवहनी प्रतिगमन अंतर्निहित तंत्र पर अध्ययन की ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान (R01 EY024963 और EY028100) द्वारा जे.सी. जेडडब्ल्यू को समर्थित किया गया था एक शूरवीरों टेम्पलर नेत्र फाउंडेशन कैरियर स्टार्टर अनुदान द्वारा समर्थित था। hyaoid अलगाव प्रक्रिया इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल से संशोधन के साथ अनुकूलित किया गया था उदारता से Drs. रिचर्ड लैंग, Toshihide Kurihara, और लोइस स्मिथ, जिसे लेखक आभारी हैं द्वारा साझा.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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