Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea
Summary
Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades metastásicas humanas.
Abstract
Los pacientes con cáncer tienen mal pronóstico cuando la afectación del ganglio linfático (LN) está presente tanto en el carcinoma de células uroteliales de alto grado (HG-UCC) de la vejiga y el cáncer colorrectal (CRC). Más del 50% de los pacientes con UCC invasiva muscular, a pesar de la terapia curativa para la enfermedad clínicamente localizada, desarrollarán metástasis y morirán dentro de 5 años, y la CRC metastásica es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Se necesitan modelos de xenoinjerto que imitan constantemente la metástasis UCC y CRC que se observado en los pacientes. Este estudio tiene como objetivo generar modelos de xenoinjerto ortotópico (PDOX) derivados del paciente de UCC y CRC para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales LN imitando la progresión de enfermedades metastásicas humanas para la detección de fármacos. Se obtuvieron tumores frescos de UCC y CRC de pacientes consentidos sometidos a resección de HG-UCC y adenocarcinoma colorrectal, respectivamente. Co-inoculada con células HK analógicas de células estromales LN (LNSC), células UCC etiquetadas con luciferasa se inculcaron intravesically (IB) en ratones femeninos de inmunodeficiencia combinada diabética/grave (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones en ratones diabéticos no obesos/graves combinados de inmunodeficiencia (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones en ratones diabéticos no obesos/graves combinados de inmunodeficiencia (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones en ratones femeninos de inmunodeficiencia diabética no obesa/combinada grave (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones femeninos de inmunodeficiencia diabética no obesa/combinada grave (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intra ratones macho NOD/SCID. El crecimiento tumoral y la metástasis se monitorizaron semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI). Tras el sacrificio, se cosecharon, pesaron y fijaron la formalina para la hematoxilina y la eosina y la inmunohistoquímica. En nuestros modelos pDOX únicos, los tumores de xenoinjerto se asemejan a los tumores preimplantacionales del paciente. En presencia de células HK, ambos modelos tienen altas tasas de implantación tumoral medidas por pesos DE BLI y tumorales, 83,3% para UCC y 96,9% para CRC, y altas tasas de metástasis de órganos distantes (33,3% detectada metástasis hepática o pulmonar para UCC y 53,1% para CRC). Además, ambos modelos tienen una mortalidad cero por el procedimiento. Hemos establecido modelos PDOX únicos y reproducibles para HG-UCC y CRC humanos, que permiten la formación de tumores, el crecimiento y los estudios de metástasis. Con estos modelos, las pruebas de nuevos fármacos terapéuticos se pueden realizar de manera eficiente y clínicamente mimética.
Introduction
Se ha demostrado que la metástasis de los ganglios linfáticos (LN) es un indicador de pronóstico deficiente en muchas neoplasias malignas de órganos sólidos, incluido el carcinoma de células uroteliales (UCC) de alto grado de la vejiga y el cáncer colorrectal (CRC)1,2. Más de la mitad de los pacientes con UCC invasiva muscular (MIUCC), a pesar de la terapia curativa para la enfermedad clínicamente localizada, desarrollarán metástasis y morirán en un plazo de 5 años. La CRC metastásica es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos.
Se estima que en 2018 se producirán 81.190 nuevos pacientes y 17.240 muertes específicas por cáncer en 2018 en los Estados Unidos debido a la UCC de la vejiga3,4. Mientras que los pacientes predominantemente (70%) presente con enfermedad invasiva no muscular, 30% tendrá MIUCC5. A pesar de la terapia curativa (cistectomía radical [RC] con o sin quimioterapia sistémica) para la enfermedad clínicamente localizada, la mitad de los pacientes con MIUCC de la vejiga seguirán desarrollando metástasis y morirán dentro de los 5 años3. La afectación de los ganglios linfáticos se encuentra en aproximadamente el 20% al 25% de los pacientes que han sufrido RC6,7,8. La tasa de supervivencia a cinco años en pacientes con LN positivo es inferior al 35% incluso después de RC, lo que sugiere la afectación de LN como un predictor negativo crucial para el pronóstico en pacientes con UCC.
El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común diagnosticado tanto en hombres como en mujeres en los Estados Unidos. Los resultados del paciente dependen en gran medida de las características tumorales y del microambiente tumoral, como la profundidad de invasión, la afectación del LN y las metástasis de órganos distantes. Aunque la tasa de mortalidad en la CRC disminuyó en la última década debido a la detección y cirugíasefectivas, se estima que casi el 50% de los pacientes con CRC desarrollarán metástasis o enfermedad recurrente 9.
Los modelos animales pequeños proporcionan una plataforma expeditiva, reproducible y modificable para estudiar la progresión tumoral y diferentes patrones metastásicos. Actualmente no hay modelos de xenoinjertos descritos que imitan consistentemente la metástasis CRC y UCC que se ve en los pacientes. La principal vía de la metástasis distante del cáncer es a través de la diseción linfática. Nuevas investigaciones sugieren que los LN proporcionan a los tumores un microambiente único, y no sólo son objetivos estacionarios donde las células cancerosas pasan transitoriamente, sino que también juegan un papel integral al interactuar con las células cancerosas en el proceso metastásico. De hecho, nuestros estudios descubrieron que, además de educar y promover la progresión tumoral y las metástasis, el microambiente estromales LN también es responsable de la resistencia a los fármacos en CRC10,11. Nuestro laboratorio confirmó recientemente los efectos tumorígenos de las células estromales LN (LNSC) en CRC y UCC utilizando modelos de ratón de xenoinjerto ortotópico (PDOX) derivados del paciente12,13.
El desarrollo de modelos PDOX proporciona una plataforma importante para la investigación traslacional del cáncer14,15. Al mantener las principales características histológicas y genéticas de su tumor donante, los modelos PDOX se mantienen estables a través de pasajes y hacen buenas plataformas para la investigación traslacional del cáncer12,15. Los modelos de DODO se utilizan para la evaluación preclínica de fármacos, la identificación de biomarcadores y la evaluación preclínica de estrategias de medicina personalizada que permiten la predicción de los resultados clínicos. Actualmente, no hay modelos de xenoinjerto descritos que consideren la importancia de la afectación del LN y sean capaces de reproducir consistentemente el tumor primario y la metástasis de órganos distantes en CRC y UCC. En este estudio, describimos el desarrollo de modelos PDOX en ratones NOD/SCID con reproducción de enfermedades metastásicas CRC y UCC con afectación lNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
La enfermedad metastásica es responsable de la mayoría de las muertes de pacientes con cáncer. En las pruebas terapéuticas preclínicas, es crucial establecer modelos de ratón que emulen más de cerca el crecimiento tumoral humano con metástasis espontáneas de órganos distantes. El uso de modelos murinos con células cancerosas derivadas de tumores de pacientes implantados (xenoinjertos) permite una mejor comprensión de la biología tumoral y biomarcadores predictivos, así como pruebas y predicción de los efec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller y Shannon McChesney que ayudaron a iniciar estos estudios por su excelente apoyo técnico. Los autores también agradecen a Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar y Maria Latsis por su ayuda en pacientes consentidos y en el suministro de especímenes tumorales.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Referências
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
