Patient-härledda ortotopiska xenograft-modeller för Human Urotelial cellkarcinom och kolorektal cancer tumörtillväxt och spontan metastaser
Summary
Detta protokoll beskriver generering av patient-härledda ortotopiska xenograft-modeller genom intravesikalt ingjuta av höggradig urotelial cells cancerceller eller intrarektalt injicering av kolorektalcancerceller i icke-feta diabetiska/svåra kombinerade immunbrist (NOD/SCID) möss för primär tumörtillväxt och spontana metastaser under påverkan av lymfkörtel stromaceller, som härmar utvecklingen av mänskliga metastatiska sjukdomar.
Abstract
Cancer patienter har dåliga prognoser när lymfkörtel (LN) engagemang förekommer i både höggradig urotelial cellkarcinom (HG-UCC) i urinblåsan och kolorektal cancer (CRC). Mer än 50% av patienter med muskelinvasiv UCC, trots kurativ terapi för kliniskt lokaliserad sjukdom, kommer att utveckla metastaser och dö inom 5 år, och metastaserad CRC är en ledande orsak till cancerrelaterade dödsfall i USA. Xenograft-modeller som konsekvent imiterar UCC och CRC-metastaser som ses hos patienter behövs. Denna studie syftar till att generera patient-derived ortotopiska xenograft (PDOX) modeller av UCC och CRC för primär tumörtillväxt och spontana metastaser under påverkan av LN stromacellstumörer celler imitera utvecklingen av mänskliga metastaserande sjukdomar för Drug screening. Färska UCC och CRC tumörer erhölls från samtyckt patienter som genomgår resektion för HG-UCC och kolorektal adenocarcinom, respektive. Co-inokuleras med LN stromacellstumörer cell (LNSC) analoga HK celler, luciferase-märkta UCC celler var intra-vesically (IB) ingjutit till kvinnliga icke-feta diabetiker/svår kombinerad immunbrist (NOD/SCID) möss, och CRC-celler var intra-rectally (IR) injiceras i manliga nickar/SCID möss. Tumörtillväxt och metastaser övervakades varje vecka med hjälp av Mareld Imaging (bli). Vid offer, primära tumörer och mus organ skördades, vägdes, och formalin-fast för hematoxylin och eosin och immunohistokemi färgning. I våra unika PDOX-modeller liknar xenograftumörer patientens pre-implantations tumörer. I närvaro av HK celler, båda modellerna har höga tumör implantation priser mätt med BLI och tumör vikter, 83,3% för UCC och 96,9% för CRC, och hög avlägsen organmetastaser (33,3% upptäckt lever-eller lungmetastaser för UCC och 53,1% för CRC). Dessutom, båda modellerna har noll dödlighet från förfarandet. Vi har etablerat unika, reproducerbara PDOX modeller för Human HG-UCC och CRC, som möjliggör tumör bildning, tillväxt, och metastaser studier. Med dessa modeller, testning av nya terapeutiska läkemedel kan utföras effektivt och på ett kliniskt-mimetic sätt.
Introduction
Det har visats att lymfkörtel (ln) metastaser är en dålig prognostisk indikator i många solida organ maligniteter, inklusive höggradig urotelial cell carcinoma (UCC) i urinblåsan och kolorektal cancer (CRC)1,2. Över hälften av patienterna med muskelinvasiv UCC (MIUCC), trots kurativ terapi för kliniskt lokaliserad sjukdom, kommer att utveckla metastaser och dö inom 5 år. Metastaserad CRC är en ledande orsak till cancerrelaterad död i USA.
Uppskattningsvis 81 190 nya patienter och 17 240 cancerspecifika dödsfall väntas inträffa i 2018 i USA på grund av UCC av urinblåsan3,4. Patienter kommer huvudsakligen (70%) närvarande med icke-muskelinvasiv sjukdom, 30% kommer att ha MIUCC5. Trots botande terapi (radikal cystektomi [RC] med eller utan systemisk kemoterapi) för kliniskt lokaliserad sjukdom, hälften av patienterna med MIUCC av urinblåsan kommer fortfarande att utveckla metastaser och dö inom 5 år3. Lymfkörteln engagemang finns i cirka 20% − 25% av patienter som genomgått RC6,7,8. Femårig överlevnad i LN positiva patienter är mindre än 35% även efter RC, vilket tyder LN engagemang som en avgörande negativ prediktor för prognosen i UCC patienter.
Kolorektal cancer är den tredje vanligaste cancer diagnosen hos både män och kvinnor i USA. Patientens resultat beror till stor del på tumör egenskaper och tumör mikromiljö, såsom djup invasion, LN engagemang, och avlägsna organ metastaser. Även om dödligheten i CRC minskade under det senaste decenniet på grund av screening och effektiva operationer, det uppskattas att nästan 50% av CRC-patienter kommer att utveckla metastaser eller återkommande sjukdom9.
Små djurmodeller ger en snabb, reproducerbar och modifierbar plattform för att studera tumörprogression och olika metastatiska mönster. Det finns för närvarande inga beskrivna xenograft modeller som konsekvent imiterar CRC och UCC metastaser ses hos patienter. Den primära vägen för cancer avlägsen metastaser är via lymfatiska spridningen. Ny forskning tyder på att LNs ger tumörer med en unik mikromiljö, och är inte bara bara stationära mål där cancerceller transitivt passera, men också spela en viktig roll genom att interagera med cancerceller i metastaserande processen. Faktum är att våra studier upptäckte att, förutom att utbilda och främja tumör progression och metastaser, LN stromacellstumörer mikromiljö är också ansvarig för läkemedelsresistens i CRC10,11. Vårt labb bekräftade nyligen de tumorigena effekterna av LN stromacellstumörer celler (lnscs) på CRC och uccs med patient-härledda ortotopiska xenograft (pdox) musmodeller12,13.
Att utveckla pdox-modellerna utgör en viktig plattform för Translationell Cancerforskning14,15. Genom att bibehålla de viktigaste histologiska och genetiska egenskaperna hos deras givare tumör, pdox modellerna förbli stabila övergångarna och göra bra plattformar för Translationell Cancerforskning12,15. PDOX-modellerna används för preklinisk läkemedels utvärdering, biomarkör identifiering och preklinisk utvärdering av individanpassade medicinska strategier som möjliggör förutsägelse av kliniska utfall. För närvarande finns det inga beskrivna xenograft modeller som anser vikten av LN engagemang och kan konsekvent reproducera primär tumör och avlägsen organmetastaser i CRC och UCC. I denna studie beskriver vi utvecklingen av PDOX modeller i NOD/SCID möss med reproduktion av metastaserad CRC och UCC sjukdomar med LNSC engagemang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metastaserande sjukdom är ansvarig för de flesta cancerpatienter mortalitet. I prekliniska terapeutiska tester är det viktigt att upprätta musmodeller som närmast emulerar människans tumörtillväxt med spontana avlägsna organmetastaser. Använda murina modeller med implanterade patient tumör härledda cancerceller (xenografts) möjliggör en bättre förståelse av tumörbiologi och Prediktiva biomarkörer samt testning och förutsägelse av antineoplastiska effekter av nya terapier18. M?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, och Shannon McChesney som hjälpte till att initiera dessa studier för deras utmärkta tekniska stöd. Författarna tackar också Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar, och Maria Latsis för hjälp i samtyckande patienter och ge tumörprover.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Referências
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
