Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal

Summary

Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para a cirurgia do nervo facial no modelo de rato, incluindo descrições de vários padrões induziveis de lesão.

Abstract

Este protocolo descreve métodos consistentes e reprodutíveis para estudar a regeneração e inibição axonal em um modelo de lesão do nervo facial de rato. O nervo facial pode ser manipulado ao longo de toda a sua extensão, desde seu segmento intracraniano até seu curso extratemporal. Existem três tipos primários de lesão nervosa utilizados para o estudo experimental de propriedades regenerativas: esmagamento nervoso, transsecção e abertura nervosa. A gama de possíveis intervenções é vasta, incluindo manipulação cirúrgica do nervo, parto de reagentes neuroativos ou células, e manipulações centrais ou de órgãos finais. As vantagens deste modelo para estudar a regeneração nervosa incluem simplicidade, reprodutibilidade, consistência entre espécies, taxas de sobrevivência confiáveis do rato e um tamanho anatômico aumentado em relação aos modelos murina. Suas limitações envolvem uma manipulação genética mais limitada versus o modelo do rato e a capacidade regenerativa superlativa do rato, de modo que o cientista do nervo facial deve avaliar cuidadosamente os pontos de tempo para recuperação e se traduzir resultados para animais superiores e estudos humanos. O modelo de rato para lesão do nervo facial permite parâmetros funcionais, eletrofisiológicos e histomorfométricos para a interpretação e comparação da regeneração nervosa. Assim, possui um enorme potencial para promover a compreensão e o tratamento das consequências devastadoras da lesão do nervo facial em pacientes humanos.

Introduction

A lesão do nervo craniano na região da cabeça e do pescoço pode ser secundária às etiologias congênitas, infecciosas, idiopáticas, iatrogênicas, traumáticas, neurológicas, oncológicas ou sistêmicas¹. O nervo craniano VII, ou nervo facial, é comumente afetado. A incidência de disfunção do nervo facial pode ser significativa, pois afeta de 20 a 30 por 100.000 pessoas a cada ano². Os principais ramos motores do nervo facial são os ramos temporal, zigomático, bucal, mandibular marginal e cervical; dependendo do ramo envolvido, as consequências podem incluir incompetência oral ou baba, secura da córnea, obstrução do campo visual secundária à ptose, disartria ou assimetria facial^2,3. A morbidade a longo prazo inclui o fenômeno da sincinese, ou movimento involuntário de um grupo muscular facial, com tentativa de contração voluntária de um grupo muscular facial distinto. A sincinese ocular-oral é a mais comum da regeneração aberrante como sequela da lesão do nervo facial e causa comprometimento funcional, constrangimento, diminuição da autoestima e má qualidade de vida³. A lesão aos ramos individuais dita as funções que estão seletivamente comprometidas.

O tratamento clínico da lesão do nervo facial não é bem padronizado e está precisando de mais pesquisas para melhorar os resultados. Esteróides podem aliviar o inchaço agudo do nervo facial, enquanto o Botox é útil para os movimentos sincinéticos temporizados; mas, as principais opções reconstrutivas no armamentário do praticante envolvem intervenção cirúrgica através de reparação nervosa, substituição ou reanimação^3,4,5,6. Dependendo do tipo de lesão do nervo facial sustentada, o cirurgião do nervo facial pode utilizar uma série de opções. Para uma transsecção simples, a reanastomose nervosa é útil, enquanto o reparo do cabo-enxerto é mais adequado para um defeito nervoso; para uma restauração da função, o cirurgião pode escolher procedimentos de reanimação facial estática ou dinâmica. Em muitos casos de lesão do nervo facial e posterior reparação, mesmo nas mãos de cirurgiões nervosos faciais experientes, o melhor resultado ainda resulta em assimetria facial persistente e comprometimento funcional⁷.

Esses resultados subótimos estimularam extensas pesquisas sobre a regeneração do nervo facial. Amplos tópicos de interesse incluem aperfeiçoar e inovar técnicas de reparação nervosa, determinar o efeito de vários fatores de regeneração nervosa e avaliar o potencial de inibidores neurais específicos para ajudar a combater o resultado a longo prazo da sincinese^8,9,10,11. Embora os modelos in vitro possam ser usados para avaliar algumas características de fatores pró-crescimento ou inibidores, a verdadeira pesquisa translacional sobre este assunto é melhor realizada através de modelos animais traduzíveis.

A decisão de qual modelo animal utilizar pode ser desafiadora, pois os pesquisadores utilizaram tanto animais de grande porte, como ovinos e modelos de pequenos animais, como camundongos^12,13. Embora modelos de animais de grande porte ofereçam visualização anatômica ideal, seu uso requer equipamentos especializados e pessoal não disponível facilmente ou facilmente. Além disso, impulsionar um estudo para demonstrar efeito pode ser altamente proibitivo de custos e potencialmente não dentro do escopo viável de muitos centros científicos. Assim, o modelo animal pequeno é mais utilizado. O modelo do camundongo pode ser utilizado para avaliar uma série de desfechos relacionados à cirurgia do nervo facial; no entanto, o comprimento limitado do nervo pode restringir a capacidade do cientista de modelar certos padrões, como lesões de grande lacuna¹⁴.

Assim, o protótipo de murina de rato emergiu como o modelo workhorse através do qual o cientista pode realizar procedimentos cirúrgicos inovadores ou utilizar fatores inibidores ou pró-crescimento e avaliar o efeito em uma ampla gama de parâmetros de desfecho. A anatomia do nervo facial do rato é previsível e facilmente abordada de forma reprodutível. Sua escala maior, em comparação com o modelo do mouse, permite a modelagem de uma ampla gama de defeitos cirúrgicos, variando de transsecção simples a lacunas de 5 mm^15,16. Isso permite ainda a aplicação de intervenções complexas no local do defeito, incluindo a colocação tópica do fator, injeções intraneurais do fator e a colocação de isoenxertos ou pontes^{17,18,19,20,21,22,23}.

A natureza dócil do rato, sua anatomia confiável e sua propensão à regeneração nervosa eficaz permitem a coleta de muitas medidas de desfecho em resposta aos padrões cirúrgicos acima mencionados da lesão²⁴. Através do modelo de rato, o cientista do nervo facial é capaz de avaliar respostas eletrofisiológicas a lesões, desfechos histológicos nervosos e musculares através da imunohistoquímica, desfechos funcionais através do movimento de rastreamento da almofada vibrissal e avaliação do fechamento dos olhos, e alterações micro e macroscópicas por meio de microscopia fluorescente ou confocal, entre outras^{11,22,23,25,26,27,28,29}. Assim, o protocolo a seguir irá delinear uma abordagem cirúrgica para o nervo facial do rato e os padrões de lesão que podem ser induzidos.

Protocol

Todas as intervenções foram realizadas de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais (IACUC) da Universidade de Michigan antes da implementação. Foram utilizados ratos sprague-dawley adultos de dez semanas de idade. 1. Antes do dia da operação Garanta um estoque adequado de instrumentos cirúrgicos esterilizados, medicamentos analgésicos, medicamentos anestés…

Representative Results

Após o procedimento cirúrgico inicial, existem dois tipos principais de medidas de desfecho: medidas seriais no animal vivo e medidas que requerem sacrifício do animal. Exemplos de medidas seriais incluem ensaios eletrofisiológicos, como uma medição potencial de ação muscular composta30, avaliações do movimento muscular facial através de laser assistido ou videografia significa9, ou mesmo imagens ao vivo repetitivas de recrescimen…

Discussion

O modelo de lesão do nervo facial de rato emergiu como o sistema mais versátil para a avaliação de fatores neurotróficos devido à sua acessibilidade cirúrgica, padrão de ramificação e significância fisiológica^{27,29,33,34,35,36}. A combinação de demonstração de vídeo e aplicação de dados de animais transgêni…

Materials

1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B