Facial nervkirurgi i råtta modell för att studera axonal hämning och regenerering
Summary
Detta protokoll beskriver en reproducerbar strategi för facial nerv kirurgi i råtta modellen, inklusive beskrivningar av olika inducible mönster av skada.
Abstract
Detta protokoll beskriver konsekventa och reproducerbara metoder för att studera axonal regenerering och hämning i en råtta facial nerv skada modell. Ansiktsnerven kan manipuleras längs hela sin längd, från dess intrakraniella segment till dess extratemporal kurs. Det finns tre primära typer av nervskada som används för experimentell studie av regenerativa egenskaper: nervkross, transection, och nervgap. Utbudet av möjliga ingrepp är stort, inklusive kirurgisk manipulering av nerven, leverans av neuroaktiva reagenser eller celler, och antingen centrala eller end-organ manipulationer. Fördelar med denna modell för att studera nerv regenerering inkluderar enkelhet, reproducerbarhet, interspecies konsistens, tillförlitlig överlevnad av råtta, och en ökad anatomisk storlek i förhållande till murine modeller. Dess begränsningar innebär en mer begränsad genetisk manipulation kontra musen modellen och superlativ regenerativ förmåga råtta, så att ansiktsnerven vetenskapsman måste noggrant bedöma tidpunkter för återhämtning och om att översätta resultat till högre djur och studier på människa. Råttmodellen för ansiktsnerven skada möjliggör funktionella, elektrofysiologiska och histomorphometriska parametrar för tolkning och jämförelse av nervregenerering. Det har därmed en enorm potential mot att främja förståelsen och behandlingen av de förödande konsekvenserna av ansiktsnerven skada hos mänskliga patienter.
Introduction
Kranial nervskada i huvud och hals regionen kan vara sekundärt till medfödda, infektiösa, idiopatisk, iatrogen, traumatisk, neurologiska, onkologiska, eller systemiska etiologier1. Kranial nerv VII, eller ansiktsnerven, påverkas ofta. Förekomsten av ansiktsnerv dysfunktion kan vara betydande, eftersom det påverkar 20 till 30 per 100.000 personer varje år2. De viktigaste motoriska grenarna av ansiktsnerven är de tidsmässiga, zygomatiska, buccal, marginella mandibular och livmoderhalscancer grenarna; beroende på vilken gren det innebär kan konsekvenserna omfatta oral inkompetens eller dreglande, hornhinnans torrhet, bildfältsobstruktion sekundärt till ptos, dysartri eller ansiktsasymmetri2,3. Långsiktig sjuklighet omfattar fenomenet synkinesi, eller ofrivillig rörelse av en ansiktsmuskelgrupp, med försök till frivillig sammandragning av en distinkt ansiktsmuskelgrupp. Okulär-oral synkinesis är den vanligaste av avvikande förnyelse som en sequela av ansiktsnerv skada och orsakar funktionsnedsättning, förlägenhet, minskad självkänsla, och dålig livskvalitet3. Skada på enskilda grenar dikterar de funktioner som är selektivt äventyras.
Den kliniska behandlingen av ansiktsnerven skada är inte väl standardiserad och är i behov av ytterligare forskning för att förbättra resultaten. Steroider kan lindra akut ansiktsnerv svullnad, medan Botox är användbart för temporizing synkinetiska rörelser; men, de primära rekonstruktiva alternativen i utövarens beväpning innebär kirurgiskt ingrepp genom nerv reparation, substitution, eller reanimation3,4,5,6. Beroende på vilken typ av ansiktsnerven skada lidit, ansiktsnerven kirurgen kan utnyttja ett antal alternativ. För enkel transekt är nervreanastomos användbar medan kabeltransplantat reparation är bättre lämpad för en nervdefekt; för återställande av funktion kan kirurgen välja antingen statiska eller dynamiska ansiktsreanimeringsprocedurer. I många fall av ansiktsnerven skada och efterföljande reparation, även i händerna på erfarna ansiktsnerv kirurger, det bästa resultatet fortfarande resulterar i ihållande ansiktsasymmetri och funktionell kompromiss7.
Dessa suboptimala resultat har sporrat omfattande forskning om ansiktsnerven förnyelse. Breda ämnen av intresse inkluderar fullända och nyskapande nerv reparation tekniker, bestämma effekten av olika nerv regenerering faktorer, och bedöma potentialen hos specifika neurala hämmare för att bekämpa det långsiktiga resultatet av synkinesis8,9,10,11. Medan in vitro-modeller kan användas för att bedöma vissa egenskaper hos pro-tillväxt eller hämmande faktorer, är sann translationell forskning om detta ämne bäst uppnås via översättningsbara djurmodeller.
Beslutet om vilken djurmodell att använda kan vara utmanande, eftersom forskare har använt både stora djur, såsom får och små djur modeller, såsom möss12,13. Medan stora djurmodeller erbjuder idealisk anatomisk visualisering, kräver deras användning specialiserad utrustning och personal som inte är lätt eller lättillgänglig. Dessutom, driver en studie för att visa effekt kan vara mycket kostnad-oöverkomliga och potentiellt inte inom den möjliga omfattningen av många vetenskapliga centra. Således är den lilla djurmodellen oftast utnyttjas. Musen modellen kan användas för att bedöma ett antal resultat relaterade till ansiktsnerven kirurgi; Dock kan den begränsade längden på nerven begränsa forskarens förmåga att modellera vissa mönster, såsom stora gap skada14.
Således har råtta murine prototypen framträtt som arbetshäst modell genom vilken forskaren kan utföra innovativa kirurgiska ingrepp eller utnyttja hämmande eller pro-tillväxt faktorer och bedöma effekten över ett brett spektrum av resultatparametrar. Råttan ansiktsnerven anatomi är förutsägbart och lätt närmade sig på ett reproducerbart sätt. Dess större skala, i jämförelse med musmodellen, möjliggör modellering av ett brett spektrum av kirurgiska defekter, allt från enkel transection till 5 mm luckor15,16. Detta möjliggör ytterligare tillämpning av komplexa ingrepp på defektstället, inklusive topikal placering av faktor, intraneural injektioner av faktor, och placering av isografts eller broar17,18,19,20,21,22,23.
Råttans fogliga natur, dess pålitliga anatomi och dess benägenhet för effektiv nervregenerering möjliggör insamling av många resultatåtgärder som svar på de ovan nämnda kirurgiska mönstren för skada24. Via råttmodellen ansiktsnervforskaren kan bedöma elektrofysiologiska reaktioner på skador, nerv- och muskelhologiska resultat via immunohistokemi, funktionella resultat via spårningsförflyttning av vibrissala pad och bedömning av ögonstängning, och mikro- och makroskopiska förändringar via fluorescerande eller konfokalmikroskopi, bland annat11,22,23,25,26,27,28,29. Således kommer följande protokoll beskriva en kirurgisk strategi för råtta ansiktsnerven och de skademönster som kan induceras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Råttan ansiktsnerven skada modellen har dykt upp som den mest mångsidiga systemet för utvärdering av neurotrofa faktorer på grund av dess kirurgiska tillgänglighet, förgrening mönster, och fysiologiska betydelse27,29,33,34,35,36. Kombinationen av videodemonstration och tillämpning av transgena djurdata öppnar nya m?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.A.A. finansieras av American Academy of Facial Plastic and Reconstructive Surgery Leslie Bernstein Grants Program.
Materials
| 1.8% isoflurane | VetOne | 13985-030-40 | |
| 11-0 nylon microsutures | AROSuture | TK-117038 | |
| 4-0 monocryl suture | VWR | 75982-084 | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | MIF 900-006 | |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | MFCD00079028 | |
| Chlorhexidine | VWR | IC19135805 | |
| Jeweler forceps | VWR | 21909-458 | |
| Micro Weitlaner retractor | VWR | 82030-146 | |
| Micro-scissors | VWR | 100492-348 | |
| Mini tenotomy scissors | VWR | 89023-522 | |
| Number 15 scalpel blade | VWR | 102097-834 | |
| Operating microscope | Leica | ||
| Petrolatum eye gel | Pharmaderm | B002LUWBEK | |
| Sterile water | VWR | 89125-834 | |
| Tissue adhesive | Vetbond, 3M | NC9259532 | |
| Water conductor pad | Aqua Relief System | ARS2000B |
Referências
- Chan, J. Y. K., Byrne, P. J. Management of facial paralysis in the 21st century. Facial Plastic Surgery. 27 (4), 346-357 (2011).
- Razfar, A., Lee, M. K., Massry, G. G., Azizzadeh, B. Facial Paralysis Reconstruction. Otolaryngologic Clinics of North America. 49 (2), 459-473 (2016).
- Couch, S. M., Chundury, R. V., Holds, J. B. Subjective and objective outcome measures in the treatment of facial nerve synkinesis with onabotulinumtoxinA (Botox). Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30 (3), 246-250 (2014).
- Wei, L. A., Diels, J., Lucarelli, M. J. Treating buccinator with botulinum toxin in patients with facial synkinesis: A previously overlooked target. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 32 (2), 138-141 (2016).
- Cooper, L., Lui, M., Nduka, C. Botulinum toxin treatment for facial palsy: A review. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 70 (6), 833-841 (2017).
- Choi, K. H., et al. Botulinum toxin injection of both sides of the face to treat post-paralytic facial synkinesis. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 66 (8), 1058-1063 (2013).
- Yang, X. N., et al. Peripheral nerve repair with epimysium conduit. Biomaterials. 34 (22), 5606-5616 (2013).
- Banks, C. A., et al. Long-term functional recovery after facial nerve transection and repair in the rat. Journal of Reconstructive Microsurgery. 31 (3), 210-216 (2015).
- Hadlock, T. A., Kowaleski, J., Lo, D., MacKinnon, S. E., Heaton, J. T. Rodent facial nerve recovery after selected lesions and repair techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 99-109 (2010).
- Hadlock, T., et al. The effect of electrical and mechanical stimulation on the regenerating rodent facial nerve. Laryngoscope. 120 (6), 1094-1102 (2009).
- Hadlock, T., et al. Functional assessments of the rodent facial nerve: A synkinesis model. Laryngoscope. 118 (10), 1744-1749 (2008).
- Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Neurological Research. 39 (10), 926-939 (2017).
- Wanner, R., et al. Functional and Molecular Characterization of a Novel Traumatic Peripheral Nerve–Muscle Injury Model. NeuroMolecular Medicine. 19 (2-3), 357-374 (2017).
- Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. Journal of Visualized Experiments. (96), e52382 (2015).
- Maeda, T., Hori, S., Sasaki, S., Maruo, S. Effects of tension at the site of coaptation on recovery of sciatic nerve function after neurorrhaphy: Evaluation by walking-track measurement, electrophysiology, histomorphometry, and electron probe X-ray microanalysis. Microsurgery. 19 (4), 200-207 (1999).
- Zhang, F., Inserra, M., Richards, L., Terris, D. J., Lineaweaver, W. C. Quantification of nerve tension after nerve repair: Correlations with nerve defects and nerve regeneration. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (6), 445-451 (2001).
- Macfarlane, B. V., Wright, A., Benson, H. A. E. Reversible blockade of retrograde axonal transport in the rat sciatic nerve by vincristine. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 49 (1), 97-101 (1997).
- Stromberg, B. V., Vlastou, C., Earle, A. S. Effect of nerve graft polarity on nerve regeneration and function. Journal of Hand Surgery. 4 (5), 444-445 (1979).
- Sotereanos, D. G., et al. Reversing nerve-graft polarity in a rat model: The effect on function. Journal of Reconstructive Microsurgery. 8 (4), 303-307 (1992).
- Whitlock, E. L., et al. Ropivacaine-induced peripheral nerve injection injury in the rodent model. Anesthesia and Analgesia. 111 (1), 214-220 (2010).
- Lloyd, B. M., et al. Use of motor nerve material in peripheral nerve repair with conduits. Microsurgery. 27 (2), 138-145 (2007).
- Kawamura, D. H., et al. Regeneration through nerve isografts is independent of nerve geometry. Journal of Reconstructive Microsurgery. 21 (4), 243-249 (2005).
- Brenner, M. J., et al. Repair of motor nerve gaps with sensory nerve inhibits regeneration in rats. Laryngoscope. 116 (9), 1685-1692 (2006).
- Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
- Heaton, J. T., et al. A system for studying facial nerve function in rats through simultaneous bilateral monitoring of eyelid and whisker movements. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 197-206 (2008).
- Magill, C. K., Moore, A. M., Borschel, G. H., Mackinnon, S. E. A new model for facial nerve research: The novel transgenic Thy1-GFP rat. Archives of Facial Plastic Surgery. 12 (5), 315-320 (2010).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Factors limiting motor recovery after facial nerve transection in the rat: Combined structural and functional analyses. European Journal of Neuroscience. 21 (2), 391-402 (2005).
- Skouras, E., et al. Manual stimulation, but not acute electrical stimulation prior to reconstructive surgery, improves functional recovery after facial nerve injury in rats. Restorative Neurology and Neuroscience. 27 (3), 237-251 (2009).
- Bischoff, A., et al. Manual stimulation of the orbicularis oculi muscle improves eyelid closure after facial nerve injury in adult rats. Muscle and Nerve. 39 (2), 197-205 (2009).
- Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves. Journal of Visualized Experiments. (86), e51181 (2014).
- Placheta, E., et al. Macroscopic in vivo imaging of facial nerve regeneration in Thy1-GFP rats. JAMA Facial Plastic Surgery. 17 (1), 8-15 (2015).
- Moore, A. M., et al. A transgenic rat expressing green fluorescent protein (GFP) in peripheral nerves provides a new hindlimb model for the study of nerve injury and regeneration. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 19-27 (2012).
- Grosheva, M., et al. Early and continued manual stimulation is required for long-term recovery after facial nerve injury. Muscle and Nerve. 57 (1), 100-106 (2018).
- Grosheva, M., et al. Comparison of trophic factors’ expression between paralyzed and recovering muscles after facial nerve injury. A quantitative analysis in time course. Experimental Neurology. 279, 137-148 (2016).
- Grosheva, M., et al. Local stabilization of microtubule assembly improves recovery of facial nerve function after repair. Experimental Neurology. 209 (1), 131-144 (2008).
- Angelov, D. N., et al. Mechanical stimulation of paralyzed vibrissal muscles following facial nerve injury in adult rat promotes full recovery of whisking. Neurobiology of Disease. 26 (1), 229-242 (2007).
- Tomov, T. L., et al. An example of neural plasticity evoked by putative behavioral demand and early use of vibrissal hairs after facial nerve transection. Experimental Neurology. 178 (2), 207-218 (2002).
- Streppel, M., et al. Focal application of neutralizing antibodies to soluble neurotrophic factors reduces collateral axonal branching after peripheral nerve lesion. European Journal of Neuroscience. 15 (8), 1327-1342 (2002).
- Peeva, G. P., et al. Improved outcome of facial nerve repair in rats is associated with enhanced regenerative response of motoneurons and augmented neocortical plasticity. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2152-2162 (2006).
- Pavlov, S. P., et al. Manually-stimulated recovery of motor function after facial nerve injury requires intact sensory input. Experimental Neurology. 211 (1), 292-300 (2008).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Experimental Neurology. 172 (1), 70-80 (2001).
- Guntinas-Lichius, O., Angelov, D. N., Stennert, E., Neiss, W. F. Delayed hypoglossal-facial nerve suture after predegeneration of the peripheral facial nerve stump improves the innervation of mimetic musculature by hypoglossal motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 387 (2), 234-242 (1997).
- Sinis, N., et al. Electrical stimulation of paralyzed vibrissal muscles reduces endplate reinnervation and does not promote motor recovery after facial nerve repair in rats. Annals of Anatomy. 191 (4), 356-370 (2009).
- Kiryakova, S., et al. Recovery of whisking function promoted by manual stimulation of the vibrissal muscles after facial nerve injury requires insulin-like growth factor 1 (IGF-1). Experimental Neurology. 222 (2), 226-234 (2010).
- Banati, R. B., et al. Early and rapid de novo synthesis of Alzheimer βA4-Amyloid precursor protein (APP) in activated microglia. Glia. 9 (3), 199-210 (1993).
- Blinzinger, K., Kreutzberg, G. Displacement of synaptic terminals from regenerating motoneurons by microglial cells. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 85 (2), 145-157 (1968).
- Rieske, E., et al. Microglia and microglia-derived brain macrophages in culture: generation from axotomized rat facial nuclei, identification and characterization in vitro. Brain Research. 492 (1-2), 1-14 (1989).
- Matsumoto, K., et al. Peripheral nerve regeneration across an 80-mm gap bridged by a polyglycolic acid (PGA)-collagen tube filled with laminin-coated collagen fibers: A histological and electrophysiological evaluation of regenerated nerves. Brain Research. 868 (2), 315-328 (2000).
- Mattsson, P., Janson, A. M., Aldskogius, H., Svensson, M. Nimodipine promotes regeneration and functional recovery after intracranial facial nerve crush. Journal of Comparative Neurology. 437 (1), 106-117 (2001).
- Yian, C. H., Paniello, R. C., Gershon Spector, J. Inhibition of motor nerve regeneration in a rabbit facial nerve model. Laryngoscope. 111 (5), 786-791 (2001).
- Angelov, D. N., et al. Nimodipine accelerates axonal sprouting after surgical repair of rat facial nerve. Journal of Neuroscience. 16 (3), 1041-1048 (1996).
