הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות
Summary
כאן, אנו מדגימים תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופרת משלוח (משופר) של וקטורים ויראלי לתוך קליפת המוח כגישה יעילה ומפושטת להשגת ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים במוחו של מקוק.
Abstract
בפרימטים שאינם אנושיים (NHP) אלקטרואופטיקה, הדבקת אזורים קורטיקליים גדולים עם וקטורים ויראליות היא לעתים קרובות משימה קשה זמן רב. כאן, אנו מדגימים את השימוש של תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופר משלוח (למעלה) של אלקטרואופטיקה וקטורים ויראלי לתוך המגע הראשוני (S1) ו מנוע (M1) ממדקים של קופי לקבל יעיל, ביטוי קליפת המין הנרחב של ערוצי יונים רגישים לאור. Adeno-הקשורים ויראלי (aav) וקטורים קידוד האדום העביר אופסין C1V1 התמזגו חלבון פלורסנט צהוב (eyfp) הוזרקו לתוך קליפת התוכי רזוס ques תחת MR-מונחה על. שלושה חודשים פוסט אינפוזיה, הדמיה אפיפלורנטית אישר אזורים גדולים של ביטוי אלקטרואופטיקה (> 130 מ”מ2) ב M1 ו S1 בשני מקופי. יתר על כן, הצלחנו להקליט אמין אור מעורר התגובות האלקטרופיזיולוגיה מאזורי הביטוי באמצעות מיקרו-electrocorticographic מערכים. ניתוח היסטולוגית מאוחר יותר וכנגד העיתונאי חשף ביטוי אופגנטי נרחב וצפוף ב-M1 ו-S1 המתאימים להפצה המצוינת על ידי הדמיה אפיפלורנטית. טכניקה זו מאפשרת לנו להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בתוך תקופה קצרה יותר של זמן עם נזק מינימלי לעומת טכניקות מסורתיות והוא יכול להיות גישה אופטימלית עבור אלקטרואופטיקה משלוח נגיפי בעלי חיים גדולים כגון NHPs. גישה זו ממחישה פוטנציאל רב לתפעול ברמת הרשת של מעגלים עצביים עם ספציפיות לסוג התא במודלים של בעלי חיים הקרובים ביותר לבני אדם.
Introduction
אלקטרואופטיקה היא כלי רב עוצמה המאפשר מניפולציה של פעילות עצבית וחקר חיבורי הרשת במוח. יישום טכניקה זו בפרימטים לא אנושיים (NHPs) יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את ההבנה שלנו של חישוביות עצבית בקנה מידה גדול, קוגניציה והתנהגות במוח הפרימטים. למרות אלקטרואופטיקה יושמה בהצלחה nhps בשנים האחרונות1,2,3,4,5,6,7, אתגר כי פנים החוקרים משיג רמות גבוהות של ביטוי על פני אזורי מוח גדולים בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים גישה יעילה ופשוטה כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בקופי. טכניקה זו יש פוטנציאל גדול לשפר את המחקרים אלקטרואופטיקה הנוכחי בבעלי חיים אלה בשילוב עם הקלטת המדינה האמנות8,9 ו גירוי אופטי10 טכנולוגיות.
הסעה משופרת משלוח (למעלה) היא שיטה הוקמה של משלוח של סוכני תרופתי ומולקולות גדולות אחרות, כולל וקטורים ויראלי, למערכת העצבים המרכזית11,12,13. בעוד שיטות המסירה המקובלת כרוכות במספר חליטות של נפח נמוך מספר מפוזרים על פני אזורים קטנים במוח, משרד הרישוי יכול להשיג הפצה רחבה יותר ואפילו יותר של הסוכן עם פחות חליטות. זרימת נוזל בצובר מונחה לחץ (הסעה) במהלך האינפוזיה מאפשר התמרה נרחבת יותר ואחידה מופץ של רקמת היעד בעת אספקת וקטורים ויראלי עם לח. במחקרים שנעשו לאחרונה, הדגמנו את התמרה ואת הביטוי האופגנטי העוקב של אזורים גדולים של מנוע ראשי (M1) והסוחושי (S1) הקורמיתיים9 ו תלמוס14 באמצעות תהודה מגנטית (MR)-מונחה.
כאן, אנו מתווה את השימוש ב-, כדי להשיג ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים עם רק כמה זריקות קורטיקלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתווה טכניקה אפשרית ויעילה להשגת ביטוי האופגנטי בקנה מידה גדול ב-NHP המוח העיקרי של התפקוד המוטורי וקליפת המנוע של MR-מונחה. השימוש MR-מונחה מציג יתרונות משמעותיים על שיטות מסורתיות של עירוי ויראלי במוח NHP. יתרון אחד כזה הוא היכולת להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים ובעלי חליטות פחות נד?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית למחקר בתר-דוקטורט (AY), הגנה מתקדמים מחקר פרויקטים הסוכנות (DARPA) התארגנות ופלסטיות כדי להאיץ שחזור פציעה (תיקון; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, ועל ידי המרכז לדימות מדעי המוח. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של יוניס קנדי רעד של בריאות הילד & התפתחות האדם של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס מספר K12HD073945, המרכז הלאומי לחקר הפרימטים של וושינגטון (WaNPCR, וסטנג p51 OD010425), ו המרכז למדעי המוח (CNT, מרכז המדע הלאומי לחקר הנדסת בסיס במסגרת גרנט EEC-1028725). אנו מודים לקאמילו דיאז-בוטיה, טים הנסון, ויקטור ח’אזייה, דניאל סילברסמית ‘, קארן ג’יי מקלאוד, ג’וליאנה, ובלייקלי אנדרוס על עזרתם בניסויים ובנאן טיאן, ג’יווי הוא, פיטר לדוצ’ניש, מישל מהריביז, וטוני האון לעזרה טכנית.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
Referências
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
