ऑनलाइन एमआरआई छवियों के मार्गदर्शन के तहत Rhesus Macakue के कोर्टेक्स के लिए Optogenetic Adeno-संबद्ध वायरल वेक्टर की Convection बढ़ी डिलीवरी
Summary
यहाँ, हम चुंबकीय अनुनाद (एमआर) निर्देशित संवहन बढ़ाया वितरण (CED) कॉर्टेक्स में वायरल वैक्टर के एक कुशल और सरलीकृत दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शित करने के लिए बड़े cortical क्षेत्रों में macacue मस्तिष्क में optogenetic अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए.
Abstract
गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी) ऑप्टोजेनेटिक्स में, वायरल वैक्टर के साथ बड़े cortical क्षेत्रों को संक्रमित करना अक्सर एक कठिन और समय लेने वाला कार्य होता है। यहाँ, हम चुंबकीय अनुनाद (एमआर) निर्देशित संवहन बढ़ाया वितरण (सीईडी) के प्राथमिक somatosensory में optogenetic वायरल वैक्टर के उपयोग का प्रदर्शन (S1) और मोटर (M1) macacues के cortices के कुशल प्राप्त करने के लिए, व्यापक cortical अभिव्यक्ति प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनल. एडीनो-संबद्ध वायरल (एएवी) वेक्टर्स को लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन सी1वी 1 को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईईएफपी) में शामिल किया गया था, एमआर-गाइडेड सीईडी के तहत रीसस मैकैक के प्रांतस्था में इंजेक्ट किया गया था। तीन महीने के बाद infusion, epifluorescent इमेजिंग optogenetic अभिव्यक्ति के बड़े क्षेत्रों की पुष्टि की (gt; 130 मिमी2) M1 में और S1 दो macacues में. इसके अलावा, हम माइक्रो-इलेक्ट्रोकोर्टिकोग्राफिक सरणियों का उपयोग कर व्यक्त क्षेत्रों से विश्वसनीय प्रकाश-evoked इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने में सक्षम थे। बाद में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और रिपोर्टर के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग ने एम 1 और एस 1 में व्यापक और घने ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति का खुलासा किया जो एपिफ्लोरेसेंट इमेजिंग द्वारा इंगित वितरण के अनुरूप था। इस तकनीक हमें पारंपरिक तकनीकों की तुलना में कम से कम नुकसान के साथ समय की एक छोटी अवधि के भीतर प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों में अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है और ऐसे NHPs के रूप में बड़े जानवरों में optogenetic वायरल वितरण के लिए एक इष्टतम दृष्टिकोण हो सकता है. इस दृष्टिकोण पशु मॉडल developmentally मनुष्यों के करीब में सेल प्रकार विशिष्टता के साथ तंत्रिका सर्किट के नेटवर्क स्तर हेरफेर के लिए महान क्षमता को दर्शाता है.
Introduction
Optogenetics एक शक्तिशाली उपकरण है कि तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर और मस्तिष्क में नेटवर्क कनेक्शन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. गैर मानव primates में इस तकनीक को लागू करने (NHPs) प्राइमेट मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर तंत्रिका गणना, अनुभूति, और व्यवहार की हमारी समझ को बढ़ाने की क्षमता है. यद्यपि हाल के वर्षों में एन एच पी में ओपीपी में ऑप्टोजेनेटिक्स को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है1,2,3,4,5,6,7, एक चुनौती है कि शोधकर्ताओं का सामना इन जानवरों में बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों में अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त कर रहा है. यहाँ, हम एक कुशल और सरलीकृत दृष्टिकोण प्रदान कर रहे हैं macacues में प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों में optogenetic अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए. इस तकनीक के राज्य के अत्याधुनिक रिकॉर्डिंग8,9 और ऑप्टिकल उत्तेजना10 प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में इन जानवरों में वर्तमान optogenetic अध्ययन में सुधार करने के लिए महान क्षमता है।
Convection बढ़ाया वितरण (सीईडी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र11,12,13के लिए वायरल वैक्टर सहित औषधीय एजेंटों और अन्य बड़े अणुओं की डिलीवरी की एक स्थापित विधि है। जबकि पारंपरिक वितरण विधियों मस्तिष्क के छोटे क्षेत्रों में वितरित कई कम मात्रा अर्क शामिल, CED कम अर्क के साथ व्यापक और अधिक भी एजेंट वितरण प्राप्त कर सकते हैं. जलसेक के दौरान दबाव संचालित थोक तरल प्रवाह (संवहन) सीईडी के साथ वायरल वैक्टर पहुंचाने पर लक्ष्य ऊतक के अधिक व्यापक रूप से और समान रूप से वितरित ट्रांसडक्शन के लिए अनुमति देता है। हाल के अध्ययनों में, हम ट्रांसडक्शन और बाद में optogenetic प्राथमिक मोटर के बड़े क्षेत्रों की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन (M1) और somatosensory (S1) cortices9 और thalamus14 चुंबकीय अनुनाद का उपयोग (एमआर) निर्देशित सी.डी.
यहाँ, हम केवल कुछ cortical इंजेक्शन के साथ बड़े cortical क्षेत्रों में optogenetic अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए सीईडी के उपयोग की रूपरेखा.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम MR निर्देशित सीईडी द्वारा एनएचपी प्राथमिक somatosensory और मोटर प्रांतस्था में बड़े पैमाने पर optogenetic अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए एक व्यावहारिक और कुशल तकनीक रूपरेखा. MR निर्देशित सीईडी का उपयोग एनएच…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन postdoctoral फैलोशिप (AY), रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाओं एजेंसी (DARPA) पुनर्गठन और प्लास्टिक द्वारा समर्थित किया गया था चोट वसूली में तेजी लाने के लिए (REPAIR; N66001-10-सी-2010), R01. NS073940, और UCSF तंत्रिका विज्ञान इमेजिंग सेंटर द्वारा. यह काम भी यूनिस कैनेडी शिवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के पुरस्कार संख्या K12HD073945, वाशिंगटन राष्ट्रीय प्राइमेट अनुसंधान केंद्र (WaNPCR, P51 OD010425) के तहत, और न्यूरोटेक्नोलॉजी के लिए केंद्र (CNT, अनुदान EEC-1028725) के तहत एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन इंजीनियरिंग अनुसंधान केंद्र. हम Camilo Diaz-Botia, टिम Hanson, विक्टर Kharazia, डैनियल Silvermith, करेन जे MacLeod, Juliana मिलानी, और ब्लेकली एंड्रयूज प्रयोगों और नान Tian, Jiwei वह, पीटर Ledochowitsch, मिशेल Mahrbiz, और टोनी Haun तकनीकी मदद के लिए उनकी मदद के लिए धन्यवाद.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
Referências
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