A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI
Summary
Aqui, nós Demonstramos a ressonância magnética (Sr.)-a entrega aumentada da convecção guiada (CED) de vetores virais no córtice como uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais no cérebro do macaque.
Abstract
No primata não-humano (NHP) optogenética, infectando grandes áreas corticais com vetores virais é muitas vezes uma tarefa difícil e demorada. Aqui, Nós demonstramos o uso de ressonância magnética (RM)-guiada por convecção reforçada de entrega (CED) de vetores virais optogenéticos em córtices primários somatosensorial (S1) e motor (M1) de macacos para obter uma expressão cortical eficiente e generalizada de canais iônicos sensíveis à luz. Os vetores virais adeno-associados (AAV) que codificam o opsina vermelho-deslocado C1V1 fundidos à proteína fluorescente amarela (EYFP) foram injetados no córtice de macacos do rhesus o Sr.-guiado CED. Três meses após a infusão, a imagem latente epifluorescente confirmou grandes regiões da expressão optogenética (> 130 milímetros2) em M1 e em S1 em dois macaques. Além disso, nós pudemos gravar respostas luz-evocadas confiáveis da electrofisiologia das áreas expressando usando matrizes micro-electrocorticographic. A análise histológica mais atrasada e a imunomarcação de encontro ao repórter revelaram a expressão optogenética difundida e densa em M1 e em S1 que correspondem à distribuição indicada pela imagem latente epifluorescente. Esta técnica permite-nos obter a expressão através das grandes áreas do córtice dentro de um período de tempo mais curto com dano mínimo comparado às técnicas tradicionais e pode ser uma aproximação óptima para a entrega viral optogenética em grandes animais tais como nhps. Esta aproximação demonstra o grande potencial para a manipulação do rede-nível de circuitos neural com célula-tipo especificidade em modelos animais evolutionarmente perto dos seres humanos.
Introduction
Optogenetics é uma ferramenta poderosa que permite a manipulação da atividade neural e o estudo das conexões de rede no cérebro. A implementação desta técnica em primatas não humanos (NHPs) tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da computação neural em grande escala, cognição e comportamento no cérebro do primata. Embora a optogenética tenha sido implementada com sucesso em nhps nos últimos anos1,2,3,4,5,6,7, um desafio que pesquisadores enfrentam está alcançando altos níveis de expressão em grandes áreas cerebrais nesses animais. Aqui, nós estamos fornecendo uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir níveis elevados de expressão optogenética através das grandes áreas do córtice nos macaques. Esta técnica tem um grande potencial para melhorar a atual estudos optogenéticos nestes animais em combinação com o estado-da-arte de gravação8,9 e estimulação óptica10 tecnologias.
O fornecimento aprimorado de convecção (CED) é um método estabelecido de entrega de agentes farmacológicos e outras grandes moléculas, incluindo vetores virais, para o sistema nervoso central11,12,13. Considerando que os métodos convencionais de parto envolvem múltiplas infusões de baixo volume distribuídas em pequenas regiões do cérebro, a CED pode alcançar uma distribuição mais ampla e uniforme do agente com menos infusões. O fluxo de fluido a granel acionado por pressão (convecção) durante a infusão permite transdução mais ampla e uniformemente distribuída do tecido alvo ao entregar vetores virais com CED. Em estudos recentes, nós Demonstramos a transdução e a expressão optogenética subseqüente de grandes áreas do motor preliminar (M1) e dos córtices somatosensory (S1)9 e do tálamo14 usando a ressonância magnética (Sr.)-guiada CED.
Aqui, nós esboçamos o uso de CED para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais com somente algumas injeções corticais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós esboçamos uma técnica viável e eficiente para conseguir a expressão optogenética em grande escala no córtice somatosensory e do motor preliminar de NHP pelo Sr.-guiado CED. O uso da CED guiada por MR apresenta vantagens significativas sobre os métodos tradicionais de infusão viral no cérebro de NHP. Uma dessas vantagens é a capacidade de atingir a expressão em grandes áreas com menos infusões necessárias. Por exemplo, com métodos convencionais, múltiplas injeções de 1-2 μl da expressão de r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association pós-doutorado Fellowship (AY), defesa avançada pesquisa projetos agência (DARPA) reorganização e plasticidade para acelerar a recuperação de lesões (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e pelo centro de imagiologia da neurociência UCSF. Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde infantil Eunice Kennedy Shiver & desenvolvimento humano dos institutos nacionais de saúde o prêmio número K12HD073945, o Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e o centro de Neurotecnologia (CNT, um centro nacional de ciência da Fundação de engenharia de pesquisa a subvenção CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews por sua ajuda com os experimentos e NaN Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun para obter ajuda técnica.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
Referências
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