Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen
Summary
Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.
Abstract
Volwassen neurogenese is een dynamisch proces waarbij nieuw geactiveerde neurale stamcellen (nscs) in de subgranulaire zone (sgz) van de getand gyrus (DG) nieuwe neuronen genereren, die integreren in een bestaand neurale circuit en bijdragen aan specifieke hippocampal functies . Belangrijk, volwassen neurogenese is zeer gevoelig voor milieu stimuli, die het mogelijk maakt voor activiteit afhankelijke regulering van verschillende cognitieve functies. Een breed scala van neurale circuits uit verschillende hersengebieden organiseert deze complexe cognitieve functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe specifieke neurale schakelingen volwassen neurogenese reguleren. Hier beschrijven we een protocol voor het manipuleren van neurale circuit activiteit met behulp van Designer receptor uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) technologie die NSCs en pasgeboren nakomelingen bij knaagdieren reguleert. Dit uitgebreide protocol omvat stereotaxic injectie van virale deeltjes, chemogenetische stimulatie van specifieke neurale circuits, thymidine analoge toediening, weefsel verwerking, immunofluorescentie labeling, confocale beeldvorming en beeldvorming analyse van verschillende stadia van neurale precursor cellen. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies over de technieken voor het ophalen van antigeen die worden gebruikt om NSCs en hun nakomelingen te visualiseren en beschrijft een eenvoudige, maar effectieve manier om hersencircuits te moduleren met behulp van Clozapine N-oxide (CNO) of CNO-bevattende drinkwater en DREADDs-het uiten van virussen. De kracht van dit protocol ligt in het aanpassingsvermogen om een breed scala aan neurale circuits te bestuderen die invloed hebben op volwassen neurogenese die zijn afgeleid van NSCs.
Introduction
Volwassen neurogenese is een biologisch proces waarbij nieuwe neuronen worden geboren in een volwassene en geïntegreerd in de bestaande neurale netwerken1. Bij de mens, dit proces vindt plaats in de getand gyrus (DG) van de hippocampus, waar ongeveer 1.400 nieuwe cellen worden geboren elke dag2. Deze cellen bevinden zich in het binnenste gedeelte van het DG, dat een neurogene niche herbergt, aangeduid als de subgranulaire zone (SGZ). Hier, hippocampal volwassen neurale stamcellen (NSCs) ondergaan een complex ontwikkelingsproces volledig functionele neuronen die bijdragen aan de regulering van specifieke hersenfuncties, met inbegrip van leren en geheugen, stemming verordening, en stress response3 worden ,4,5,6. Om gedragingen te beïnvloeden, worden volwassen NSCs sterk gereguleerd door verschillende externe stimuli in een activiteitsafhankelijke manier door te reageren op een array van lokale en distale chemische signalen. Deze chemische aanwijzingen omvatten neurotransmitters en neuro modulatoren en handelen in een circuit specifieke manier uit verschillende hersengebieden. Belangrijk is dat de brede convergentie van deze chemische signalen op NSCs een unieke en precieze regulering van stamcel activering, differentiatie en noodlotbeslissingen mogelijk maakt.
Een van de meest effectieve manieren om circuit regulering van volwassen NSCs in vivo te interromen is door immunofluorescentie analyse te koppelen aan schakelingen met een breed circuit. Immunofluorescentie analyse van volwassen NSCs is een algemeen gebruikte techniek, waarbij antilichamen tegen specifieke moleculaire markers worden gebruikt om de ontwikkelingsfase van volwassen NSCs aan te duiden. Deze markers omvatten: nestin als een radiale glia cel en vroege neurale voorlopercellen marker, Tbr2 als een tussenliggende voorlopercellen marker, en DCX als een neuro blast en onvolgroeide neuron marker7. Bovendien, door het toedienen van thymidine analogen zoals Brdu, cidu, Idu, en edu, kunnen celpopulaties die S-fase ondergaan individueel worden gelabeld en gevisualiseerd8,9,10. Door deze twee benaderingen te combineren, kan een breed scala aan vragen worden onderzocht, variërend van hoe proliferatie wordt gereguleerd in specifieke ontwikkelingsstadia, tot hoe verschillende signalen de NSC-differentiatie en neurogenese beïnvloeden.
Verschillende opties bestaan om effectief te manipuleren neurale circuits met inbegrip van elektrische stimulatie, optogenetics, en chemogenetica, elk met hun eigen voor-en nadelen. Elektrische stimulatie omvat een uitgebreide operatie waarbij elektroden worden geïmplanteerd naar een specifieke hersenregio die later worden gebruikt voor het verzenden van elektrische signalen om een gerichte hersenregio te moduleren. Echter, deze aanpak mist zowel cellulaire en circuit specificiteit. Optogenetics omvat de levering van virale deeltjes die coderen een licht geactiveerde receptor die wordt gestimuleerd door een laser uitgezonden door een geïmplanteerde optische vezel, maar vereist uitgebreide manipulaties, grote kosten, en complexe operaties11. Chemogenetics omvat de levering van virale deeltjes die coderen een ontwerper receptor uitsluitend geactiveerd door designer drugs of DREADDs, die vervolgens worden geactiveerd door een specifieke en biologisch inert ligand bekend als Clozapine N-oxide (CNO)12 . Het voordeel van het gebruik van DREADDs voor het manipuleren van lokale neurale circuits die volwassen NSCs reguleren ligt in het gemak en verschillende routes van CNO administratie. Dit zorgt voor een minder tijdrovende aanpak met verminderde behandeling van dieren, die gemakkelijk aanpasbaar is voor lange termijn studies om neurale circuits te moduleren.
De aanpak beschreven in dit protocol is een uitgebreide verzameling van verschillende protocollen die nodig zijn om met succes te interroten circuit regulering van volwassen hippocampal neurogenese die zowel immunofluorescentie technieken en circuit manipulaties combineert met behulp van chemogenetica. De in het volgende protocol beschreven methode is geschikt voor het stimuleren of remmen van één of meerdere circuits tegelijkertijd in vivo om hun regelgevende functie bij volwassen neurogenese te bepalen. Deze aanpak wordt het best gebruikt als de vraag niet een hoge mate van temporele resolutie nodig heeft. Vragen die nauwkeurige temporele controle van stimulatie/remming op een bepaalde frequentie, kunnen beter worden aangepakt met behulp van optogenetics13,14. De hier beschreven aanpak is gemakkelijk aangepast voor lange termijn studies met minimale behandeling van dieren, vooral wanneer stress een grote zorg is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is om te beoordelen hoe het manipuleren van specifieke neurale circuits volwassen hippocampal neurogenese in vivo met behulp van een reeks van immunohistochemie technieken regelt. Asgezegde activiteit afhankelijke regulering van volwassen neurogenese gemedieerd door specifieke neurale circuits is een waardevolle techniek met een groot potentieel voor modificaties om een divers bereik van neurale circuits te bestuderen. Het succes van dit soort experimenten is afhankelijk van meerdere factoren, w…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. werd gesteund door het National Institute of Mental Health van de National Institutes of Health onder diversiteits supplement R01MH111773 evenals een T32 training Grant T32NS007431-20. Dit project werd gesteund door subsidies toegekend aan J.S. van NIH (MH111773, AG058160 en NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Referências
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
