Assaying Circuit spesifikk regulering av voksen hippocampus neural forløper Cells
Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en tilnærming for å analysere atferden til voksen neural Stem/stamceller som svar på chemogenetic manipulering av en bestemt lokal nevrale krets.
Abstract
Voksen neurogenesis er en dynamisk prosess som nylig aktiverte nevrale stamceller (NSCs) i subgranular sonen (SGZ) av dentate gyrus (DG) generere nye neurons, som integreres i en eksisterende nevrale krets og bidra til bestemte hippocampus funksjoner . Betydelig, voksen neurogenesis er høylig mottagelig å miljømessig stimulere, hvilke innrømmer for aktivitet-avhengig reguleringen av forskjellige Cognitive funksjonene. Et stort utvalg av nevrale kretser fra ulike hjerneområder appartefakter disse komplekse kognitive funksjoner. Det er derfor viktig å forstå hvordan spesifikke nevrale kretser regulere voksen neurogenesis. Her beskriver vi en protokoll for å manipulere nevrale krets aktivitet ved hjelp av designer reseptor eksklusivt aktiveres av designer narkotika (DREADDs) teknologi som regulerer NSCs og nyfødte avkom i gnagere. Denne omfattende protokollen inkluderer stereotaxic injeksjon av viral partikler, chemogenetic stimulering av spesifikke nevrale kretser, tymidin analog administrasjon, vevs behandling, immunofluorescence merking, konfokalmikroskopi Imaging, og Imaging analyse av ulike stadier av nevrale forløper celler. Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner om Antigen gjenfinning teknikker som brukes til å visualisere NSCs og deres avkom og beskriver en enkel, men likevel effektiv måte å modulere hjernen kretser ved hjelp av Clozapine N-oksid (CNO) eller CNO-inneholdende drikkevann og DREADDs-uttrykker virus. Styrken i denne protokollen ligger i tilpasningsdyktighet sin for å studere et mangfoldig utvalg av nevrale kretser som påvirker voksen neurogenesis avledet fra NSCs.
Introduction
Voksen neurogenesis er en biologisk prosess der nye neurons er født i en voksen og integrert i eksisterende nevrale nettverk1. Hos mennesker skjer denne prosessen i dentate gyrus (DG) av hippocampus, der om 1 400 nye celler blir født hver dag2. Disse cellene bor i den indre delen av DG, som havner en neurogenic nisje, kalt subgranular sonen (SGZ). Her, hippocampus voksen nevrale stamceller (NSCs) gjennomgår en kompleks utviklingsprosess å bli fullt funksjonell neurons som bidrar til regulering av spesifikke hjernens funksjoner, inkludert læring og hukommelse, humør regulering, og stress respons3 ,4,5,6. For å påvirke atferd, voksen NSCs er sterkt regulert av ulike eksterne stimuli i en aktivitet avhengig måte ved å svare på en rekke lokale og eksterne kjemiske signaler. Disse kjemiske stikkordene inkluderer nevrotransmittere og neuromodulatorer og opptrer i en krets spesifikk måte fra ulike hjerneområder. Viktigere, krets bredt konvergens av disse kjemiske signaler på NSCs gjør det mulig for unike og presise regulering av stilk cellen aktivisering, differensiering, og skjebnen beslutninger.
En av de mest effektive måtene å forhøre krets regulering av voksen NSCs in vivo er ved sammenkobling immunofluorescence analyse med krets bredt manipulasjoner. Immunofluorescence analyse av voksen NSCs er en vanlig benyttet teknikk, hvor antistoffer mot spesifikke molekylære markører brukes for å indikere utviklingstrinn av voksen NSCs. Disse markørene inkluderer: nestin som en radial glia celle og tidlig neural stamfar markør, Tbr2 som en mellomliggende stamfar markør, og dcx som en neuroblast og umodne Nevron markør7. Ved å administrere tymidin analogs, for eksempel BrdU, CidU, IDu og edu, kan celle populasjoner som er under S fase, være individuelt merket og visualisere8,9,10. Ved å kombinere disse to tilnærmingene kan et bredt spekter av spørsmål undersøkes fra hvordan spredning reguleres ved spesifikke utviklingstrinn, til hvordan ulike signaler påvirker NSC-differensiering og neurogenesis.
Det finnes flere alternativer for effektivt å manipulere nevrale kretser, inkludert elektrisk stimulering, optogenetics og chemogenetics, hver med sine egne fordeler og ulemper. Elektrisk stimulering innebærer en omfattende operasjon der elektroder blir implantert til en bestemt hjerne region som senere brukes til å overføre elektriske signaler for å modulere en målrettet hjerne region. Men denne tilnærmingen mangler både mobilnettet og krets spesifisitet. Optogenetics innebærer levering av viral partikler som koder en lys aktivert reseptor som stimuleres av en laser slippes ut gjennom en implantert optisk fiber, men krever omfattende manipulasjoner, store kostnader, og komplekse operasjoner11. Chemogenetics innebærer levering av viral partikler som koder en designer reseptor utelukkende aktiveres av designer narkotika eller DREADDs, som senere aktiveres av en bestemt og biologisk inert ligand kjent som Clozapine N-oksid (CNO)12 . Fordelen med å utnytte DREADDs å manipulere lokale nevrale kretser som regulerer voksen NSCs ligger i letthet og ulike ruter i CNO administrasjon. Dette gir en mindre tidkrevende tilnærming med redusert dyr håndtering, som er lett tilpasses for langsiktige studier til modulere nevrale kretser.
Tilnærmingen er beskrevet i denne protokollen er en omfattende samling av ulike protokoller som kreves for å kunne forhøre krets regulering av voksen hippocampus neurogenesis som kombinerer både immunofluorescence teknikker og krets manipulasjoner bruker chemogenetics. Metoden beskrevet i følgende protokoll er hensiktsmessig for å stimulere eller hemme en eller flere kretser samtidig in vivo for å bestemme deres regulatoriske funksjon på voksen neurogenesis. Denne tilnærmingen er best brukt hvis spørsmålet ikke trenger en høy grad av timelig oppløsning. Spørsmål som krever presis timelig kontroll av stimulering/hemming ved en viss frekvens, kan bli bedre adressert ved hjelp av optogenetics13,14. Tilnærmingen er beskrevet her er lett tilpasses for langsiktige studier med minimal dyr håndtering spesielt der stress er en stor bekymring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne protokollen er å vurdere hvordan manipulere spesifikke nevrale kretser regulerer voksen hippocampus neurogenesis in vivo ved hjelp av en rekke immunhistokjemi teknikker. Assaying aktivitet avhengig regulering av voksen neurogenesis formidlet av spesifikke nevrale kretser er en verdifull teknikk med stort potensial for modifikasjoner for å studere et mangfoldig utvalg av nevrale kretser. Suksessen til disse typer eksperimenter avhenger av flere faktorer, inkludert nøyaktig viral levering, riktig viral …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. ble støttet av National Institute of Mental Health i National Institutes of Health under mangfold supplement R01MH111773 samt en T32 trening stipend T32NS007431-20. Dette prosjektet ble støttet fra tilskudd tildelt JS fra NIH (MH111773, AG058160, og NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Referências
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
