मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न रोग मॉडल में Epigenome संपादन उपकरण के कुशल वितरण के लिए मसूरी वायरल वेक्टर मंच
Summary
लक्षित डीएनए epigenome संपादन एक शक्तिशाली चिकित्सीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन उत्पादन, शुद्धि, और एकाग्रता के सभी में एक-एक के लिए-dCas9-DNMT3A transgene के लिए CRISPR———————————–
Abstract
hiPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग मानव न्यूरोडेजेनेरेटिव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. यहां, हम पार्किंसंस रोग (पीडी)-प्रासंगिक डोपाइन्जिक्यूटिव न्यूरोनल आबादी में अल्फा-synuclein जीन (Snca) लोकस की triplication के साथ एक रोगी से व्युत्पंन hiPSCs के भेदभाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । सबूत accumulating पता चला है कि snca के उच्च स्तर पीडी के विकास के लिए करणीय संबंध हैं । को पहचानने की अपूरित पीडी के लिए उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण स्थापित करने की जरूरत है, विशेष रूप से snca अभिव्यक्ति के विनियमन लक्ष्यीकरण उन, हम हाल ही में snca intron 1 नियामक क्षेत्र में मेथिलन स्तरों को समृद्ध करने के द्वारा epigenetically रूप से snca प्रतिलेखन करने के लिए एक crispr/dCas9-डीएनए-मेथिलन आधारित प्रणाली विकसित की है । प्रणाली देने के लिए, एक मृत (निष्क्रिय) संस्करण के Cas9 (dCas9) डीएनए methyltransferase एंजाइम 3a (DNMT3A) के उत्प्रेरक डोमेन के साथ संगलित से मिलकर, एक दाल वायरल वेक्टर का उपयोग किया जाता है । इस प्रणाली snca लोकस के triplication के साथ कोशिकाओं को लागू किया जाता है और snca-mrna और प्रोटीन के स्तर के बारे में 30% द्वारा snca intron 1 के लक्षित डीएनए मेथिलन के माध्यम से कम कर देता है । SNCA के स्तर के ठीक देखते downregulation रोग से संबंधित सेलुलर phenotypes बचाता है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए तंत्रिका प्रजनक कोशिकाओं (npcs) में hipscs भेदभाव और स्थापना और snca में मेथिलन प्रोफ़ाइल के मूल्यांकन के लिए पायसेलिसिंग के सत्यापन के लिए उद्देश्य इंट्रॉन 1. के लिए और अधिक विस्तार में रूपरेखा-CRISPR/dCas9 प्रणाली इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे उत्पादन, शुद्ध करने के लिए, और लेंथ और ध्यान केंद्रित करने के लिए अपने epigenome के लिए उपयुक्तता-और जीनोम संपादन अनुप्रयोगों का उपयोग hiPSCs और NPCs. प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलनीय है और विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में के लिए उच्च अनुमापांक दाल का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
कई epigenome-संपादन प्लेटफार्मों हाल ही में जीन अभिव्यक्ति1,2नियंत्रण क्षेत्रों में किसी भी डीएनए दृश्यों को लक्षित करने के लिए विकसित किया गया है । निर्मित epigenome संपादन उपकरण (i) transcription को विनियमित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, (ii) posttranslational हिटोन संशोधनों में परिवर्तन, (iii) डीएनए methylation संशोधित, और (iv) नियामक तत्व बातचीत मिलाना. एक निष्क्रिय (मृत) Cas9 (dCas9) को पहले से विकसित epigenome-संपादन प्लेटफार्मों, जैसे जस्ता उंगली प्रोटीन (zfps) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक जैसे effectors (दास्तां) से उठाया करने के लिए ट्रांसक्रिप्शन/chromatin संशोधक लंगर करने के लिए दृष्टिकोण, एक शक्तिशाली transcriptional effector डोमेन (ED) शरण डिजाइन डीएनए बाध्यकारी डोमेन (dbd)3के लिए संगलित । इस तरह के सक्रियण या दमन के रूप में वांछित phenotype के परिणाम अमोघ loci करने के लिए लंगर डाला effector अणु द्वारा परिभाषित किया गया है (चित्रा 1). प्रोग्रामयोग्य अनुक्रियक उत्प्रेरक बनाने के लिए, dCas9/grna मॉड्यूल VP164,5,6 (चित्रा 1a), एक वायरल सक्रियण डोमेन है कि भर्ती पीओएल द्वितीय और सामांय ट्रांसक्रिप्शन मशीनरी से जुड़े हुए हैं । इस प्रणाली के संशोधन VP64 शामिल है, VP16 डोमेन के एक tetramer, एक और भी अधिक मजबूत सक्रियण दर5,6प्रदान । इस प्रणाली को प्रवर्तकों और विनियामक तत्वों को लक्षित करके कोडिंग और गैर-कोडिंग क्षेत्रों को सक्रिय करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है । महत्वपूर्ण बात, भले ही VP64 अणुओं सीधे लक्ष्य क्षेत्र में क्रोमेटिन संरचना को संशोधित नहीं करते हैं, यह रंगहीन क्रोमेटिन संशोधक जो सक्रिय (यूक्रोमेटिन) के निशान के बयान में परिणाम बाइंड, सहित h3/H4 ऐसीटिलन और h3-के४ डि/ त्रि-methylation5,6. VP64 के अलावा, मानव NF-κB परिसर की p65 उपइकाई dCas9/gRNA मॉड्यूल7के लिए सीमित कर दिया गया है । दिलचस्प है, प्रतिलेखन शुरू साइटों (tsss) के ऊपर क्षेत्रों के लिए इन effectors के tethering और एक मजबूत जीन प्रेरण में प्रवर्तकों परिणामों के भीतर । तथापि, VP64 और p65 effectors भी उत्प्रेरक प्रभाव डालती कर सकते हैं, जबकि tsss के बहाव में स्थित क्षेत्रों से जुड़ा हुआ है और बाहर enhancers7,8पर । एक और अधिक मजबूत transcriptional प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए, एक से अधिक dCas9-VP64 या dCas9-p65 fusions एक एकल लक्ष्य को9,10लोकस भर्ती की जरूरत है । इस तरह के रूप में, अगली पीढ़ी के उत्प्रेरक, जो एक dCas9-gRNA परिसर, ऐसे SunTag के रूप में एक से अधिक effector डोमेन की भर्ती के हाल के विकास, एक मजबूत सक्रियण क्षमता में हुई है dCas9-VP64 फ्यूजन समकक्षों की तुलना11 , 12. VP64, p65, और RTA (vpr), गामा-herpesviruses से एक transactivation डोमेन, dCas913 के सी-टर्मिनस के लिए (चित्रा 1a) के विलय के माध्यम से एक बेहतर transcriptional सक्रियण प्राप्त किया गया है । इसी तरह के CRISPR/dCas9 प्रणालियों को लक्षित विशिष्ट दमन (चित्र 1b) के लिए विकसित किया गया है ।
अंतर्जात जीन दमन तंत्र की एक किस्म (चित्र 1b) के माध्यम से इंजीनियर दमन fusions के साथ प्राप्त किया जा सकता है । यह प्रदर्शित किया गया है कि crispr/dCas9 सिस्टम, दमनकारी dbd से जुड़े (यहां तक कि एक effector डोमेन के बिना), कुशलता से जीन अभिव्यक्ति मौन कर सकते हैं, जबकि एक प्रमोटर या अपस्ट्रीम/डाउनस्ट्रीम-tss क्षेत्रों3,6 ,14. प्रतिलेखन पर प्रभाव प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी और आरएनए पोलीमरेज़ प्रसंस्करण के त्रिविमी हस्तक्षेप के कारण होता है । फिर भी, और अधिक व्यापक दृष्टिकोण की जरूरत है, के रूप में अकेले त्रिविमी बाधा द्वारा जीन दमन अक्सर मजबूत silencing के लिए पर्याप्त नहीं है । CRISPR/dCas9 सिस्टम पर आधारित साइलेंसरों की अगली पीढ़ी का हाल ही का विकास जो कि ट्रांसक्रिपशनल रिप्रेसर डोमेन (टीआरडीएस), हिटोन संशोधक (H3-K9 di-/tri-methylation, H3-K27 डि-/tri-methylation) को ले जा रहा है; h3-K36 di-/tri-methylation, h3/H4 deacetylation), और डीएनए (cpg) मेथिलन अधिक मजबूत साइलेंसिंग प्रभाव की अनुमति देने के लिए पश् चजात उपकरण के निर्माण के लिए नेतृत्व किया4,5,15,16, 17,18,19,20. यह प्रदर्शित किया गया है कि डीएनए के लिए इन पश् चजात संशोधक की भर्ती अधिक बंद और सघन chromatin, जो आम तौर पर एक और अधिक शक्तिशाली मुंह बंद परिणाम21,22उत्पंन के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । dbds के साथ प्रयोग किया जाता सबसे अधिक सामान्य रूप से सिलेंसिंग डोमेन krüppel-संबद्ध बॉक्स (krab)4,5है । कारक की भर्ती क्रोमेटिन परिवर्तन के साथ अनुरूप करने के लिए प्रदर्शन किया गया है; फिर भी, इन संशोधनों के तंत्र अभी तक16,17,18आविर्भाव किया जाना है । हाल ही में, यह दिखाया गया है कि krab का स्थानीयकरण डीएनए के लिए हिस्टोन methyltransferase SETDB1 और हिस्टोन deacetylation (hdac) nurd परिसरों के विधानसभा को बढ़ावा कर सकते हैं, संभावना है कि इन बातचीत के गठन मध्यस्थता सुझाव क्रोमेटिन कंडेनसेशन और transअपंग साइलेंसिंग3,13. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, effector डोमेन dbds के लिए एक कस्टम पश् चजात साइलेंसिंग प्रोटीन बनाने के लिए किया जा सकता है । इस प्रणाली को सीधे दमनात्मक डीएनए मार्क्स या हिस्टोन संशोधनों catalyzes ।
हाल ही में, सिंथेटिक CRISPR का उपयोग/dCas9 सिस्टम DNMT3A एंजाइम के लिए सीमित किया गया है transcriptional निष्क्रियण के लिए repurposed । डीएनए मेथिलन DNMT3A उत्प्रेरक है कि अंतर्जात जीन प्रमोटरों और अंय नियामक क्षेत्रों पर हेटरोक्रोमेटिन के गठन के दौरान transcriptional दमन प्रबल (चित्र 1b)18,20। मैकडॉनल्ड्स एट अल.18 और vojta एट अल.20 पहले लेखकों को रिपोर्ट है कि डीएनए मेथिलन एपिजीनोम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीन साइलेंसिंग या दमन, प्रदर्शन है कि plasmid-वितरित dCas9-DNMT3A संलयन प्रणाली को बढ़ा सकते है potently साइटोसीन मेथिलन के आसपास tss18,20। मैकडॉनल्ड्स और सहकर्मियों का प्रदर्शन है कि रणनीति के रोजगार में एक महत्वपूर्ण कमी का परिणाम हो सकता है (के बारे में ४०%) एक ट्यूमर दमनकारी जीन में, CDKN2A mrna के स्तर18। इसी तरह, बाख या IL6ST जीन के unmethylated प्रमोटर क्षेत्र को लक्षित करने से पता चलता है बढ़ cpg मेथिलन कि जीन अभिव्यक्ति20में एक दोहरा कमी के साथ सहसंबद्ध किया गया है । हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में snca overexpression (चित्रा 2)23के रोग परिणामों attenuating के लिए डीएनए मेथिलन के उपयोग repurposed है । रणनीति snca intron 1 क्षेत्र के भीतर डीएनए मेथिलन में चयनात्मक वृद्धि पर आधारित है, के रूप में यह पहले से PD और मनोभ्रंश में lewy निकायों (dlb) दिमाग24,25के साथ hypomethylated होने की सूचना दी थी, 26. इस hyंतरण snca overexpression से जोड़ा गया है, इस प्रकार चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए एक आकर्षक लक्ष्य की पेशकश24,27,28। हम हाल ही में snca intron 1 क्षेत्र में डीएनए मेथिलन के hipsc में एक कम स्तर दिखाया-dopaminergic npcs snca triplication23के साथ एक पीडी रोगी से प्राप्त की । इस प्रायोगिक मॉडल का लाभ यह है कि npcs की संस्कृति में प्रचार किया जा सकता है या आगे परिपक्व ंयूरॉंस में विभेदित, एक कुशल स्क्रीनिंग को सक्षम करने के लिए आनुवंशिक कारकों की पहचान है कि मध्यस्थता सेलुलर phenotypes सहित, oxidative तनाव और एपोटोप्सिस29। इसके अलावा, इस मॉडल प्रणाली के वैज्ञानिकों के विकास की घटनाओं है कि रोगियों में लक्षण शुरुआत से पहले हुई पुनर्पूंजीकरण के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, hiPSC व्युत्पंन NPCs एक महान उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए सेलुलर और आणविक जीन अभिव्यक्ति के साथ जुड़े रास्ते का परीक्षण । महत्वपूर्ण बात, hiPSC व्युत्पंन NPCs के राज्य के साथ संयुक्त-कला CRISPR/Cas9-epigenome प्रौद्योगिकी बहुत “के विकास की सुविधा कर सकते है अगली पीढ़ी के दवाओं” कई न्यूरोडेजेनेरेटिव रोगों के लिए ।
snca अभिव्यक्ति के रोग के स्तर को कम करने के लिए, हम हाल ही में एक dCas9-DNMT3A संलयन प्रोटीन और grna के लिए विशेष रूप से snca intron 1 (चित्रा 2a)23के भीतर cpg मेथिलन लक्ष्य ले जाने के लिए एक दाल वायरस आधारित प्रणाली विकसित की है । इस प्रोटोकॉल में विस्तार से लैंटलवायरल वेक्टर (LV) डिजाइन और प्रोडक्शन का वर्णन होगा । LVs कई कारणों के लिए CRISPR/dCas9 घटकों को वितरित करने के एक प्रभावी साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं, अर्थात् (i) भारी डीएनए आवेषण करने की उनकी क्षमता, (ii) कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रेणी ट्रांसड्यूसिंग की एक उच्च दक्षता, जिसमें दोनों विभाजित और अविभाजित कक्ष शामिल हैं30 , और (iii) उनके ंयूनतम साइटोटोक्सिक और immunogenic प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने की क्षमता । हाल ही में, हम hipsc के लिए lv प्रणाली लागू- snca लोकस की triलोचनों के साथ एक रोगी से dopaminergic ंयूरॉंस व्युत्पंन और epigenome के वितरण के लिए lv के चिकित्सकीय क्षमता का प्रदर्शन-संपादन मेथिलन उपकरण23 ( चित्र 2B) । दरअसल, एक lv-grna/dCas9-DNMT3A प्रणाली snca intron 1 क्षेत्र में डीएनए मेथिलन में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनता है । यह वृद्धि Snca mrna और प्रोटीन के स्तर में कमी के साथ मेल खाती है23। इसके अलावा, snca Downregulation snca Triplication/hipsc व्युत्पंन dopaminergic ंयूरॉंस में पीडी-संबंधित phenotypes बचाता है (जैसे, mitochondrial ROS उत्पादन और सेल व्यवहार्यता)23। महत्वपूर्ण बात, हम प्रदर्शन किया है कि एसएनसीए अभिव्यक्ति में कमी Lv-grna द्वारा-DCAS9-DMNT3A प्रणाली phenotypes जो hipsc के लिए विशेषता-एक पीडी रोगी जो किया से डोप्नेरिजिक ंयूरॉंस व्युत्पंन के पीछे करने में सक्षम है मिटोकोड्रियल ROS उत्पादन और सेल व्यवहार्यता23के रूप में snca triलोचनीयता, । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है 1) उत्पादन और उच्च tittered वायरल तैयारी और 2) पैदा करने के लिए एक अनुकूलित lv मंच के एकाग्रता के प्रोटोकॉल की रूपरेखा को npcs में hipscs के भेदभाव का वर्णन करने के लिए परिपक्व dopaminergic बन नमूनों ंयूरॉंस31,३२ और snca intron के भीतर लक्षित क्षेत्र के मेथिलन स्तर के लक्षण वर्णन 1 ।
the सबसे लोकप्रिय वेक्टर मंच पर एक प्रमुख लाभ है, अर्थात् adeno-एसोसिएटेड वैक्टर (aavs), जो है पूर्व की क्षमता को समायोजित करने के लिए बड़ा आनुवंशिक आवेषण३३,३४। AAVs काफी अधिक पैदावार पर उत्पंन किया जा सकता है लेकिन एक कम पैकेजिंग क्षमता के अधिकारी (< 4.8 केबी), सभी में एक CRISPR/Cas9 सिस्टम देने के लिए उनके उपयोग समझौता । इस प्रकार, ऐसा लगता है कि LVs के मंच होगा-CRISPR के वितरण में शामिल अनुप्रयोगों में पसंद/dCas9 उपकरण । इसलिए, प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित शोधकर्ताओं के लिए एक मूल्यवान उपकरण को प्रभावी ढंग से epigenome-संपादन घटकों कोशिकाओं और अंगों को देने की इच्छा होगी । प्रोटोकॉल आगे रणनीति वेक्टर अभिव्यक्ति कैसेट30,३५के भीतर तत्वों के सीआईएस में एक संशोधन के माध्यम से उत्पादन और वैक्टर की अभिव्यक्ति क्षमताओं को बढ़ाने के लिए रूपरेखा । रणनीति विकसित और हमारी प्रयोगशाला में अध्ययन किया उपंयास प्रणाली पर आधारित है और 1010 वायरल इकाइयों (VU)/एमएल30,३५की रेंज में वायरल कणों का उत्पादन करने की क्षमता पर प्रकाश डाला गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs epigenome संपादन के लिए पसंद के वाहन के रूप में उभरने के लिए शुरू कर दिया है, विशेष रूप से आनुवंशिक रोगों के संदर्भ में, मुख्य रूप से (मैं) बड़ी डीएनए पेलोड समायोजित करने की क्षमता के कारण और (ii) कुशलतापूर्वक वि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के भाग में क्हान Neurotechnology विकास पुरस्कार (O.C.) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान/राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (NIH/NINDS) (R01 NS085011 O.C.) के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Referências
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