レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル
Summary
編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン レンチウイルスベクターの濃度について説明します-ニューロンを派生しました。
Abstract
による細胞の使用は、人間の神経変性疾患の研究に貴重なアプローチを表します。ここでは、α-シヌクレイン遺伝子 (SNCA) 座の 3 倍にパーキンソン病 (PD) 患者由来 hiPSCs の差別化のための最適化されたプロトコルについて述べる-関連するドーパミン作動性ニューロン集団。SNCAの高レベルが特にこれらのSNCA表現の規制をターゲット、PD の新規治療法を確立する必要は満たされていない討認識の開発の原因となることを示している証拠の蓄積我々最近 epigenetically SNCAイントロン 1 規制地域でメチル化レベルを富ませることによってSNCAの転写を調節する CRISPR/dCas9-DNA メチル化-ベースのシステムを開発しました。死んでから成るシステムを提供する Cas9 の (非アクティブ) バージョン (dCas9) は、DNA メチル基転移酵素酵素 3 a の触媒ドメインと融合 (DNMT3A)、レンチ ウイルスのベクトルを使用しています。このシステムは、 SNCA遺伝子座の 3 倍のセルに適用されます、 SNCAmRNA および蛋白質レベルSNCAイントロン 1 のターゲット DNA のメチル化を約 30% 削減します。SNCA レベルの微調整のダウンレギュレーションは、病気に関連した細胞表現を救出します。現在のプロトコルの神経前駆細胞 (Npc) と確立とSNCAのメチル化プロファイルの評価ピロシーケンス法の検証 hiPSCs を区別するための手順を説明を目指しますイントロン 1.詳細にこれらの実験で使用するレンチ-CRISPR/dCas9 システムのアウトラインを作成するには、このプロトコル記述を生成し、浄化、レンチウイルスベクターを集中およびエピゲノムとゲノムの編集アプリケーションを使用して自分の適性を強調表示する方法hiPSCs と Npc。プロトコルは、容易に適応可能であるし、in vitro および in vivo のアプリケーションのための高価レンチを生成する使用ことができます。
Introduction
複数のエピゲノム編集プラットフォームは、最近遺伝子式1,2を制御する領域の任意の DNA シーケンスをターゲットとして開発されたが。作成したエピゲノム編集ツールは、(i) の転写を調節する、(ii) 変更ヒストン翻訳後修飾、(iii) DNA のメチル化の変更、(iv) 規制要素の相互作用を調節するのに設計されています。非アクティブ化された (死んで) Cas9 に転写・ クロマチン修飾子をアンカーへのアプローチ (dCas9) 発生以前から亜鉛などの先進のエピゲノム編集プラットフォーム指蛋白質 (ZFPs) と転写活性化因子のようなエフェクタ (テイルズ)強力な転写エフェクター ドメインをかくまっている (ED) の設計の DNA 結合ドメイン (DBD)3を融合しました。活性化や抑圧など所望の表現型の結果は、内在性の遺伝子座 (図 1) に固定されてエフェクター分子によって定義されます。プログラム可能な転写活性化因子を作成するには、dCas9/gRNA モジュールは VP164,5,6 (図 1 a)、Pol II と一般転写機械をリクルートするウイルス活性化ドメインにリンクされます。このシステムの変更は、VP64、VP16 ドメインの四量体よりも強力な活性化率5,6を提供する含まれています。システムは、正常にプロモーターと規制要素をターゲットしてコーディングおよび非翻訳領域をアクティブに採用されています。重要なは、にもかかわらず、VP64 分子は、ターゲット領域のクロマチン構造を直接変更しないでください、それはクロマチンの修飾子は H3 ・ H4 アセチル化と H3 K4 di としてを含むアクティブ (ユークロマチン) マークの沈着の結果をバインドを募集/tri-メチル化5,6。VP64、に加えて人間の NF-κ B の複合体の p65 サブユニットを dCas9/gRNA モジュール7に繋留されています。興味深いことに、強い遺伝子発現誘導の結果地域上流転写開始部位 (TSSs) とプロモーター内にこれらのエフェクターのテザリングします。それにもかかわらず、VP64、p65 のエフェクタにリンクされている遠位エンハンサー7、8TSSs の下流側にある地域も賦活効果を発揮できます。堅牢な転写応答を引き出す複数の dCas9 VP64 または dCas9 p65 の融合が単一ターゲットの軌跡9,10に募集する必要があります。DCas9 VP64 融合対応11比較活性化強力な機能で単一 dCas9 gRNA 複合体、SunTag などによって複数のエフェクター ドメインを採用する次世代の活性剤の最近の開発をもたらしたなど,12. 転写制御の改善、VP64、p65、Rta (VPR)、dCas913 (図 1 a) の C 末端に γ-ヘルペス ウイルスの転写活性化ドメインの融合によって取得されました。同様の CRISPR/dCas9 システムは、ターゲット固有の抑圧 (図 1 b) に開発されています。
内因性遺伝子の抑圧は、さまざまなメカニズム (図 1 b) を人工リプレッサーの融合で実現できます。(なくてもエフェクター ドメイン/s) は、リプレッサー DBD にリンク CRISPR/dCas9 システムが遺伝子発現プロモーターや上流/下流 TSS 地域3,6 につながれたときに沈黙が効率的にそれが実証されています、14。転写に及ぼす影響は、転写因子結合と RNA ポリメラーゼ加工立体干渉が原因です。それにもかかわらず、単独で立体障害によって遺伝子発現抑制が頻繁に堅牢な沈黙のために十分より包括的なアプローチが必要です。転写リプレッサー ドメイン (Trd) ヒストン修飾子を運ぶ CRISPR/dCas9 システムに基づくサイレンサーの次世代の最近の開発 (H3 K9 ディ-/トリ メチル化、H3 K27 ディ-/tri-メチル化;H3-K36 ・ ディ ・-/トリ メチル化、脱アセチル化 H3 ・ H4)、およびエピジェネティックなサイレンシング効果4,5,15,16より堅牢なツールの建設につながった (CpG) DNA メチル化 17,18,19,20。それは、DNA にこれらのエピジェネティックな修飾子の募集は通常より強力なサイレンシング結果21,22に生成より閉鎖と凝縮したクロマチンの形成につながることを実証されています。つながれてで使用される最も一般的サイレンシング ドメインは Krüppel 関連付けられているボックス (ボブ)4,5です。要因の採用は、クロマチンの変化に対応する実証されています。それにもかかわらず、これらの変更のメカニズムはまだ解明16,17,18をします。最近では、それは DNA に KRAB の局在化はヒストン メチルトランスフェラーゼ SETDB1 のヒストンの脱アセチル化 (HDAC) NuRD 複合体で、これらの相互作用の形成を仲介する可能性が示唆されたアセンブリを促進することが示されています。chromatin の凝縮が、転写のサイレンシング3,13。別のアプローチとしてエフェクター ドメインはつながれてカスタム エピジェネティックなサイレンシング蛋白質を作成するために融合されます。このシステムは、抑圧的な DNA のマークやヒストンの修正に直接触媒します。
最近、DNMT3A 酵素につながれた合成の CRISPR/dCas9 システムの使用用途が変更されて転写不活性化のため。DNMT3A 内因性遺伝子プロモーターと他の規制地域 (図 1 b)18,20異質染色質の形成を通して転写抑制を発揮する DNA のメチル化を触媒します。マクドナルドら18とボイタら20エピゲノム遺伝子サイレンシングまたはプラスミド配信 dCas9 DNMT3A の融合システムが高めることができる強力デモ抑圧用 DNA のメチル化することができますを報告する最初の作家であったTSS18,20前後のシトシンのメチル化。マクドナルドと同僚戦略の雇用により、大幅に低減 (約 40%) されることを示した腫瘍抑制遺伝子CDKN2A mRNA レベル18です。同様に、バッハやIL6ST遺伝子の非メチル化プロモーター領域をターゲット遺伝子発現20二重減少と相関している増加の CpG メチル化を示しています。私たちの研究室は最近SNCA過剰発現 (図 2)23の病理結果を減衰のため DNA のメチル化の使用を再利用します。戦略に基づくSNCAイントロン 1 領域内での DNA メチル化の選択的強化以前 PD と痴呆 Lewy ボディ (DLB) 脳24,25、hypomethylated に報告されました。 26。この低いメチル化は、 SNCAの過剰発現は、治療的介入24,27,28にとって魅力的なターゲットを提供していますにリンクされています。我々 は最近、 SNCAイントロン 1 のSNCA 3 倍23PD 患者から得られたこと由来ドーパミン Npc の領域 DNA のメチル化の低レベルを示した。この実験モデルの利点は、Npc の文化で確実伝達またはさらに酸化を含む細胞の表現型を仲介する遺伝的要因を識別するために有効なスクリーニングを可能に成熟したニューロンに区別できることストレス、アポトーシス29。さらに、このモデル システムにより患者の症状発現前に生じた発達のイベントを要約する科学者です。さらに、Npc のこと由来は遺伝子発現に関連する細胞・分子経路をテストするための素晴らしいツールを表します。重要なは、CRISPR/Cas9-エピゲノム技術と組み合わせること由来の Npc では、多くの神経変性疾患の「次世代治療薬」の開発が非常に容易します。
SNCA 式の病理組織学的レベルを減らすためには、最近 dCas9 DNMT3A 融合タンパク質と具体的ターゲット CpG のメチル化SNCAイントロン 1 (図 2 a) 内に gRNA を運ぶレンチ ベースのシステムを開発した23。このプロトコルは、レンチウイルスベクター (LV) の設計・製作の詳細について説明します。LVs を表す CRISPR/dCas9 コンポーネントを提供するいくつかの理由のための効果的な手段、すなわち (i) かさばる DNA を運ぶ能力を挿入します、(ii)30 分割と非分裂細胞を含む細胞の広い範囲の高効率、および (iii) 最小限の細胞毒性や免疫反応を誘導する能力を。最近、 SNCA遺伝子座の 3 倍の患者から LV システムをによる由来ドーパミン作動性ニューロンに適用してエピゲノム編集の配信の LVs の治療の可能性を示すメチル化ツール23 (図 2B)。確かに、LV gRNA/dCas9 DNMT3A システムSNCAイントロン 1 領域における DNA メチル化の大幅な増加が発生します。この増加は、 SNCA mRNA および蛋白質23のレベルの減少で対応しています。また、 SNCAダウンレギュレーションSNCA 3 倍/による由来ドーパミン作動性ニューロン (例えば、ミトコンドリア ROS 生産と細胞生存率)23で PD に関連した表現を救出します。重要なは、我々 は実証 LV-gRNA-dCas9-DMNT3A システムによるSNCA発現の減少は、を行った PD 患者からによる由来ドーパミン作動性ニューロンの特徴である表現型を反転が可能SNCA 3 倍に、ミトコンドリア ROS 生産と細胞生存率23など。このプロトコルの目的は、生産のプロトコルおよび濃度ウイルス製剤の高 tittered を生成するための最適化された LV プラットフォームの概要を説明するには 1) と 2) hiPSCs の成熟したドーパミンになるパターンの Npc への分化を説明するにはニューロン31,32とSNCAイントロン 1 内の対象領域のメチル化レベルの評価。
レンチ ウイルス プラットフォームすなわちアデノ随伴ベクトル (通気)、大きい遺伝的挿入33,34に対応する元の能力である最も人気のあるベクトル プラットフォーム上の大きな利点があります。通気は有意に高い利回りで生成することができますが、低包装容量を所有 (< 4.8 kb)、オール イン ワン CRISPR/Cas9 システムを提供するための使用を損なうこと。したがって、それは LVs の CRISPR/dCas9 ツールの配信に関連するアプリケーションのプラットフォームの選択になるようです。したがって、ここで説明したプロトコルは細胞や臓器にエピゲノム編集コンポーネントを効果的に配信することを望む研究者にとって貴重なツールになります。プロトコルをさらにベクトル式カセット30,35内の要素の cis 諸国における変更を介してベクトルの生産と表現能力を増すための戦略の概要を説明します。戦略は基づいています小説にシステム開発し私たちの研究室で勉強し、1010ウイルス ユニット (VU)/mL30,35の範囲でウイルス粒子を生成する能力を強調表示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs は、遺伝性疾患の中で特に、エピゲノムの編集のための最適な手段として浮上し始めている、主に能力 (i) に対応するため大規模な DNA ペイロード、および (ii) 効率的に変換分割の広い範囲と非分裂細胞。LVs の大型包装効果が特大 CRISPR/dCas9 システムのパッケージを含むアプリケーションは特に有益です。このような観点からは、LVs は、オール イン ワン CRISPR/Cas9 システムの配信のための?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はカーン ニューロ開発賞受賞 (の OC) と国家機関の健康/国立研究所の神経疾患脳卒中 (NIH/NINDS) 部分で資金が供給された (R01 NS085011 の OC に)。
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Referências
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